The role of Raptor in adult skeletal muscle

Skeletal muscle is the largest organ in the body comprising 40% of total body mass. Skeletal muscle mass is the result of an equilibrium between protein synthesis and protein breakdown. When protein synthesis overcomes protein degradation the result is muscle hypertrophy with increased fiber size. Better understanding of the signaling pathways controlling muscle mass and function is of great importance. Indeed so far there are no therapeutic approaches that can prevent or reduce muscle wasting, as seen in aging and muscular dystrophy. While various studies have identified important regulators of adult skeletal muscle mass, little is known about how these pathways can modulate muscle function. One of the main pathways regulating skeletal muscle is the Akt-mTOR pathway. Under anabolic conditions, mTOR is activated, leading to increased protein synthesis through the phosphorylation of S6K1 and 4EBP1. On the other hand, mTOR activation can also lead to the inhibition of protein degradation through the phosphorylation of Ulk1, which is involved in the autophagosome formation. mTOR assembles into two distinct multiprotein complexes, namely the rapamycin-sensitive complex mTORC1 and the rapamycin-insensitive complex mTORC2. While mTORC2 is mainly involved in cytoskeleton reorganization, mTORC1 plays a role in cell growth and protein synthesis. One of the key members of the mTORC1 is a 150kDa protein called Raptor, which has been shown to be able to recruit mTOR substrates S6K1 and 4EBP1 on mTORC1, promoting their phosphorylation (Hara et al., 2002) (Kim et al., 2002). Mice lacking Raptor only in skeletal muscle from birth show a pronounced myopathy leading to premature death (Bentzinger et al., 2008). However, treating adult mice with the specific mTORC1 inhibitor rapamycin does not lead to a myopathic phenotype and even improves muscle physiology in aged mice (Harrison et al., 2009). So, we wondered what happens if Raptor is deleted in adult skeletal muscle. We, therefore, generated an inducible muscle-specific Raptor knock-out mouse line (HSA-Raptor ko). One month of Raptor deletion in adult muscle does not affect muscle mass or muscle morphology. In addition, also muscle force production is comparable between control and knock-out animals, confirming that at this time point there are no myopathies. Since in literature it has been reported that deletion of Raptor from birth leads to premature death around 5-6 months of age, we decided to monitor mice lifespan and body weight for a longer period after deletion. We observed that body weight during these months is unchanged between wt and Raptor ko mice, so we decided to sacrifice mice 7 months after the beginning of the treatment to assess muscle histology. At this time point, muscles from Raptor ko mice showed signs of a muscle myopathy, with centronucleated fibers, a high number of small and large muscle fibers, central structures and inflammation. In addition, we observed that Raptor knock-out muscles show a huge amount of spontaneous fibrillation spikes at rest, suggesting the presence of denervated fibers. Furthermore, mitochondrial membrane potential and respiratory chain complex activity are impaired upon Raptor deletion. These features result in compromised muscle performance and exercise intolerance. Moreover, while metabolic characteristics upon Raptor deletion shift from oxidative to glycolytic fibers with glycogen accumulation, structural properties reveal the opposite behaviour, with a shift from fast- to slow- twitch fibers. This is likely linked to the increased activity of calcineurin- NFAT pathway seen in Raptor ko muscles. Since understanding the key players in the regulation of muscle mass can be of therapeutic interest, we wanted to understand the role of Raptor during Akt-induced hypertrophy. So, we generate an inducible muscle- specific Akt-Raptor ko mouse line. Akt overexpression results in a strong increase in cross-sectional area of muscle fibers, which is only partially reduced upon Raptor deletion. Moreover, fiber hypertrophy is completely blunted when Akt-Raptor ko mice are treated with the mTORC1 inhibitor, rapamycin. We also found that Akt-Raptor ko mice are significantly weaker than controls, meaning that Akt-induced hypertrophy in the absence of Raptor is not functional anymore. In addition, this effect is not reverted by rapamycin administration, as seen in Akt-S6K1 knock-out mice (Marabita et al., 2016).

I muscoli scheletrici costituiscono il 40% di tutto l’organismo. Il tessuto muscolare è un tessuto molto plastico e dinamico che si adatta in relazione ai diversi stimoli. La massa muscolare è il risultato di un equilibrio tra sintesi e degradazione proteica: una maggior sintesi delle proteine muscolari porta infatti ad ipertrofia mentre una maggior degradazione associata ad una ridotta sintesi ha come conseguenza uno stato atrofico del muscolo. Una migliore conoscenza delle vie di segnale che regolano la crescita e la funzione muscolare diventano di particolare importanza terapeutica per prevenire la perdita di massa associata sia all’invecchiamento, che a diverse patologie, quali ad esempio distrofie e sclerosi. Una delle vie maggiormente implicate nella regolazione della crescita muscolare è la via Akt-mTOR. In condizioni anaboliche, mTOR è attivo e promuove la sintesi proteica attraverso la fosforilazione di S6K1 e 4EBP1. Inoltre, mTOR va anche a bloccare la degradazione proteica attraverso l’inibizione di una proteina che partecipa alla formazione dell’autofagosoma, Ulk1. mTOR esiste sotto forma di due complessi multiproteici: mTORC1, implicato nella crescita cellulare, e mTORC2, che regola la riorganizzazione del citoscheletro. Uno dei componenti principali di mTORC1 è la proteina Raptor, che è in grado di reclutare i substrati di mTORC1, quali ad esempio S6K1 e 4EBP1, promuovendone la fosforilazione (Hara et al., 2002) (Kim et al., 2002). Topi in cui Raptor è assente nel muscolo scheletrico dalla nascita sviluppano una severa miopatia, risultante in una morte prematura degli animali (Bentzinger et al., 2008). Tuttavia, il trattamento di topi adulti con rapamicina, che inibisce selettivamente mTORC1, non porta a patologie muscolari e, anzi, migliora la fisiologia del muscolo di topi anziani (Harrison et al., 2009). Considerando questi risultati contradditori, ci siamo chiesti quale sia il ruolo di Raptor nel muscolo adulto. Abbiamo, quindi, generato un modello murino in cui Raptor viene deleto nel muscolo scheletrico in maniera inducibile. Un mese di delezione di Raptor non ha effetti sulla morfologia o sulla funzionalità del muscolo. Considerando che in letteratura i topi knock-out per Raptor dalla nascita muoiono attorno ai 5-6 mesi, abbiamo deciso di monitorare il peso corporeo e la durata della vita per un periodo di tempo maggiore. Abbiamo notato che, durante questi mesi, il peso rimane invariato tra i topi controllo e i topi knock-out; abbiamo, quindi, deciso di sacrificare gli animali 7 mesi dopo l’inizio del trattamento per controllare l’istologia del muscolo. A questo punto, i muscoli dei topi Raptor ko mostrano segni miopatici, con fibre centronucleate, fibre atrofiche e ipertrofiche, strutture centrali e infiammazione. Inoltre, abbiamo notato che i muscoli knock-out presentano fibrillazioni spontanee e quindi attività elettrica a riposo, suggerendo la presenza di fibre denervate. La delezione di Raptor, inoltre, ha portato ad una severa depolarizzazione mitocondriale e ad una ridotta attività di alcuni complessi della catena respiratoria. Tutti questi effetti sono facilmente collegabili alla significativa debolezza muscolare osservata in questi topi. Dal momento che una più approfondita conoscenza dei mediatori maggiormente implicati nella crescita muscolare può essere di interesse terapeutico, abbiamo deciso di generare una nuova linea murina in cui Akt viene espresso e Raptor deleto solo nel muscolo scheletrico in maniera inducibile al fine di valutare quale sia il ruolo di Raptor nella crescita indotta dall’overespressione di Akt. Nei topi Akt-Raptor ko, l’ipertrofia delle fibre muscolari è solo parzialmente ridotta in confronto a quella osservata nei topi Akt. Incredibilmente, il trattamento con rapamicina significativamente diminuisce la crescita indotta da Akt, anche in assenza di Raptor. Inoltre, i topi Akt-Raptor ko mostrano una ridotta forza muscolare, suggerendo che l’ipertrofia dipendente da Akt in assenza di Raptor non è più funzionale. Quest’effetto non è normalizzato neanche dalla somministrazione di rapamicina, com’era stato visto nei topi Akt- S6K1 ko (Marabita et al., 2016).