The role of MCU in vertebrate development and physiology using zebrafish (Danio rerio) as a model organism

Calcium signaling is fundamental for decoding a variety of extra- and intra-cellular signaling pathways and for the regulation of many cellular functions. Mitochondria play a fundamental role in controlling Ca2+ dynamics inside the cell. Their strategic subcellular distribution ensures the efficient coupling between the release of Ca2+ from the stores and its uptake into the organelle, thus guaranteeing the control of the cell death/cell survival pathways and of the energy homeostasis. Since the identification of the mitochondrial calcium uniporter (MCU) and its regulators, the biochemical and molecular characterization of the mechanisms underlying mitochondrial Ca2+ contribution to cell homeostasis made a great step forward. The MCU-/- mouse model firstly described had an unexpected mild phenotype, the severity of which, however, depends on the genetic background, thus underlying a role of MCU during embryogenesis. Our work aims to explore the contribution of MCU and mitochondrial Ca2+ dynamics in the regulation of vertebrate development and organogenesis, exploiting the zebrafish (Danio rerio) as a model organism. To downregulate Mcu, we injected morpholino antisense oligonucleotides (MOs) to block mcu mRNA translation. Mcu downregulation was validated using Western blot analysis and the strong decrease in protein expression level was accompanied by altered Ca2+ dynamics. Mitochondrial morphology was not significantly altered upon Mcu downregulation. Mcu morphants develop without gross morphological abnormalities, although they show a slight reduction in size and the functional analysis of embryo locomotor activity revealed an impairment in the touch-evoked escape response. We performed analysis of skeletal muscle development using phalloidin staining, evaluated muscle birefringence and performed immunofluorescence analysis of fiber type with specific antibodies and we found defects in skeletal muscle fiber organization, loss of an ordered myofibrillar structure and alterations in the morphology and arrangement of slow and fast myofibers. Analysis of the motor neuron population evidenced a reduction in the number of motor neuron cells and a defective branching of their axons in mcu morphants. Transmission electron microscopy revealed an altered myofiber ultrastructure in mcu morphants due to the presence of abundant sarcoplasmic reticulum vesicles, disruption of the ordered myofibrillar structure, enlarged and disarranged triads and less electron dense mitochondria with a lower amount of cristae. As skeletal muscle differentiation and motor neuron pathfinding are intimately connected processes during embryogenesis and pioneer adaxial cells are required for driving motor neuron axon growth, we analysed their distribution and our results indicate a remarkable mislocalization of these cells and a strong reduction in their number in mcu morphants. This deficit may be responsible for the defective skeletal muscle-motor neuron developmental axis. In addition, we show that mcu morphants are more sensitive to oxidative stress and have a significantly lower basal and maximal respiration. These results highlight the fundamental contribution of Mcu and mitochondrial Ca2+ uptake to metabolism and energy production in the developing embryo. We generated two mutant lines using CRISPR-Cas9 technology. Both mutations are located in exon1 of mcu locus and lead to a mcu null mutant. We are currently characterizing the lines but preliminary data show many similarities with what obtained with the knockdown approach. Mutant fish reach adulthood but display metabolic alterations. Our results highlight the fundamental contribution of Mcu and mitochondrial Ca2+ uptake in vertebrate development and the differentiation and maturation of both skeletal muscle tissue and motor neuron network. The characterization of mcu-/- fish will help to further elucidate the involvement of mitochondrial Ca2+ in vertebrate organogenesis, physiology and pathology.

I mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dei segnali Ca2+ cellulari. Essi infatti accumulano Ca2+ in seguito al suo rilascio dai depositi, prevenendone l’eccessivo accumulo nel citosol. Il Ca2+ che entra nell'organello svolge un ruolo chiave nel regolare il metabolismo, stimolare la respirazione e quindi la produzione di ATP, nonché controllare l’attivazione delle vie di sopravvivenza e morte cellulare. L’identificazione del gene per l’uniporto mitocondriale del calcio (MCU) ha permesso la caratterizzazione molecolare del ruolo del Ca2+ mitocondriale nell’omeostasi cellulare e tessutale. Il primo modello di topo MCU-/- descritto nel 2013 dimostrava un fenotipo relativamente lieve, ma la sua severità dipende grandemente dal genotipo considerato, il che suggerisce un ruolo di MCU durante l'embriogenesi. Questo lavoro di tesi si è focalizzato sulla caratterizzazione del ruolo di MCU durante lo sviluppo dei vertebrati, impiegando lo zebrafish (Danio rerio) come animale modello. Utilizzando un approccio di genetica inversa, l’espressione di Mcu è stata silenziata mediante l’iniezione di oligonucleotidi morfolino antisenso specifici per mcu (mcuMO) in uova di zebrafish fecondate. I morfanti mcu non dimostrano evidenti alterazioni morfologiche e i loro mitocondri appaiono normali, nonostante l’espressione di Mcu sia minima e i transienti di Ca2+ mitocondriali risultino drammaticamente ridotti. I morfanti mcu presentano solo ridotte dimensioni e una significativa diminuzione dell'attività locomotoria, probabilmente legata ad alterazioni del tessuto muscolare scheletrico. Gli embrioni silenziati per mcu, infatti, presentano anomalie nella morfologia e distribuzione dei diversi tipi di fibra muscolare, perdita dell’organizzazione miofibrillare sarcomerica dovuta ad un compartimento sarcoplasmatico allargato, e cambiamenti ultrastrutturali nelle cristae mitocondriali rispetto ai controlli. Inoltre, l'analisi della popolazione motoneuronale nei morfanti mcu a 48 hpf ha evidenziato una riduzione del numero di motoneuroni e una diminuita ramificazione dei loro assoni. Dato che muscolo scheletrico e componente motoneuronale hanno uno sviluppo strettamente interconnesso durante l'embriogenesi e una popolazione di cellule muscolari, chiamate “adaxial”, è fondamentale per il corretto orientamento degli assoni dei motoneuroni, abbiamo analizzato la loro distribuzione in embrioni morfanti e relativi controlli. I morfanti possiedono un ridotto numero e una mislocalizzazione di queste cellule “adaxial”, il che potrebbe essere la causa dei difetti riscontrati nell’asse neuro-muscolare osservato in presenza del silenziamento di mcu. Inoltre, l’analisi del metabolismo di embrioni a 4 giorni di sviluppo ha dimostrato che i morfanti mcu hanno una respirazione, sia basale che massima, significativamente più bassa dei controlli e sono più sensibili allo stress ossidativo. Per poter studiare il ruolo di Mcu a stadi di sviluppo successivi e nell’adulto, abbiamo generato delle linee mutanti di zebrafish (mcudel14 e mcuins20) in cui l’espressione di Mcu è stabilmente abrogata, tramite la tecnologia CRISPR/Cas9. La loro caratterizzazione è attualmente in corso ma analisi preliminari confermano il fenotipo osservato nei pesci morfanti mcu. I pesci mutanti infatti raggiungono l'età adulta e sono fertili, ma mostrano riduzioni delle dimensioni corporee e alterazioni metaboliche. I nostri risultati evidenziano quindi il contributo fondamentale di Mcu e dell'accumulo mitocondriale di Ca2+ nello sviluppo dei vertebrati e, in particolare, nella regolazione del metabolismo e del differenziamento muscolare e motoneuronale durante lo sviluppo. La caratterizzazione dei mutanti mcu-/- aiuterà a chiarire ulteriormente il coinvolgimento del Ca2+ mitocondriale nella funzionalità di organi e tessuti in condizioni fisiologiche e, possibilmente, patologiche.