Towards an increased biocompatibility in total heart replacements: a new hybrid membrane for artificial blood pumps and the whole bioengineered heart

The only definitive treatment currently used for end-stage heart failure (HF) is cardiac transplantation. However, the procedure is limited by organ shortage and the side-effects of life-long immunosuppression. The need for new therapeutic strategies paved the way for the development of mechanical circulatory supports (e.g., total artificial hearts, TAHs) and the whole bioengineered heart. Although the two approaches may appear to be in conflict, TAHs are intended for short- to middle-term applications and can be developed and clinically applied relatively faster; the bioengineered heart approaches a definitive solution but, although current results are promising, a full organ equivalent has not yet been achieved. The creation of a novel TAH internal lining and the generation of a decellularized matrix for total heart bioengineering were the aim of this doctoral thesis, in order to improve the common goal of biocompatibility in formulating whole heart replacements. The TAH approach was investigated by coupling a TriCol-decellularized bovine pericardial scaffold (DBP) with a medical-grade polycarbonate urethane. This combination gave rise to a hybrid membrane (HM) capable of overcoming materials’ reciprocal limitations. The DBP was assessed by histology, two-photon microscopy (TPM)-combined immunofluorescence and TPM-mediated morphometric quantifications. Following HM assembly, surface analyses showed that the polymer penetrated the DBP scaffold. In vitro cytocompatibility was performed according to ISO 10993-5 with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBM-MSCs). All tests confirmed unaltered morphology, proliferation, viability, and absence of cytotoxicity. No activation of the complement system, part of ISO 10993-4, was reported for HM. The poor endothelialization and occurrence of thromboembolism in TAH may be prevented by accelerating endothelial adhesion through immobilization of short synthetic peptides. TriCol DBP scaffolds were selectively and covalently linked by Arg-Glu-Asp-Val (REDV) and rhodamine-conjugated REDV (RhodREDV) at different concentrations. After functionalization, the amount of bound RhodREDV was quantified with a TPM. The bioactivity of REDV was evaluated by in vitro static seeding of HUVECs. Live/dead staining and MTS reduction quantification demonstrated improved early adhesion, viability and proliferation of HUVECs on 10-5 M REDV-functionalized DBP at 24 hours. The LDH assay reported negligible levels of cytotoxicity. Histological evaluations revealed a near-continuous type of cell lining. The first step towards whole heart bioengineering was performed by developing a preservative decellularization protocol for cardiac organs. Rat hearts were decellularized by a combination of myorelaxant, protease inhibitors, sodium dodecyl sulfate (SDS) and Triton X-100. All solutions were administered by retrograde coronary perfusion. The effectiveness of the protocol was evaluated by histology, TPM-combined immunofluorescence, DNA quantification, and proteomic analysis. Cytocompatibility was assessed according to ISO 10993-5 by static seeding of hBM-MSCs on isolated ventricles. The results confirmed unaltered morphology, maintained proliferation and the absence of cytotoxicity. Histology showed continuous monolayer of hBM-MSCs at 24 hours, whereas cell penetration was visible at days 7 and 14. Concluding, this doctoral thesis describes the progresses towards the biocompatibility of heart replacements. A first generation of HM, based on DBP and polyurethane, was created and demonstrated its suitability for TAH internal lining. The covalent and selective functionalization of 10-5 M REDV peptide on DBP proved its efficacy in accelerating endothelial adhesion and promoting cell proliferation. A more preservative and cytocompatible protocol for whole heart decellularization was developed and achieved complete cell removal well-maintaining cardiac matrix.

Il trapianto di cuore è l’unico trattamento dell’insufficienza cardiaca terminale, ma la sua applicazione è limitata dalla carenza di organi e dagli effetti collaterali delle terapie immunosoppressive. La necessità di nuove strategie terapeutiche ha portato allo sviluppo delle assistenze meccaniche ed al cuore bioingegnerizzato. Sebbene possano sembrare in contrasto, i cuori artificiali totali (TAH) sono impiantati a breve/medio termine e possono essere sviluppati ed introdotti nella clinica più rapidamente, mentre il cuore bioingegnerizzato si avvicina ad una soluzione definitiva, ma nonostante i risultati promettenti non è ancora stato prodotto un organo equivalente completo. La creazione di un nuovo rivestimento interno per i TAH e la generazione di una matrice decellularizzata per la bioingegnerizzazione del cuore sono stati l’obiettivo di questa tesi di dottorato al fine di migliorare la biocompatibilità dei sostituti cardiaci. Il rivestimento per i TAH è stato realizzato accoppiando pericardio bovino decellularizzato TriCol (DBP) ad un poliuretano, producendo una membrana ibrida (HM). Il DBP è stato valutato con istologie, immunofluorescenza combinata con microscopia a due fotoni (TPM) e quantificazione morfometrica. Le analisi superficiali della HM hanno mostrato la penetrazione del polimero. La citocompatibilità in vitro (ISO 10993-5) è stata valutata con cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC) e mesenchimali staminali derivate da midollo osseo umano (hBM-MSC). I test hanno confermato inalterate morfologia, proliferazione, vitalità ed assenza di citotossicità. Nessuna attivazione del sistema del complemento (ISO 10993-4) è stata segnalata per HM. La scarsa endotelizzazione ed il verificarsi di tromboembolia nei TAH possono essere prevenuti accelerando l’adesione endoteliale con brevi peptidi sintetici. Gli scaffold TriCol DBP sono stati selettivamente e covalentemente legati ad Arg-Glu-Asp-Val (REDV) e REDV coniugato con rodamina (RhodREDV). Dopo la funzionalizzazione, la quantità di RhodREDV legato è stata quantificata con il TPM. La bioattività di REDV è stata valutata mediante semina statica di HUVEC in vitro. Il live/dead staining e la quantificazione della riduzione di MTS hanno dimostrato adesione precoce e migliore vitalità e proliferazione delle cellule nei DBP funzionalizzati con 10-5 M di REDV a 24 ore. Il saggio LDH ha riportato livelli trascurabili di citotossicità. Le valutazioni istologiche hanno rivelato un rivestimento cellulare quasi continuo. Il primo passo verso la bioingegnerizzazione del cuore è stato eseguito sviluppando un protocollo di decellularizzazione più conservativo. I cuori di ratto sono stati decellularizzati con miorilassante, inibitori delle proteasi, sodio dodecil solfato e Triton X-100. Le soluzioni sono state somministrate mediante perfusione coronarica retrograda. L’efficienza del protocollo è stata valutata con istologie, immunofluorescenza combinata con TPM, quantificazione del DNA e analisi proteomica. La citocompatibilità è stata eseguita mediante semina statica di hBM-MSC in ventricoli isolati (ISO 10993-5). I risultati hanno confermato morfologia inalterata, mantenimento della proliferazione e assenza di citotossicità. Le hBM-MSC hanno formato un monolayer continuo a 24 ore, mentre a 7 e 14 giorni era visibile la penetrazione. Concludendo, questa tesi di dottorato descrive i progressi verso la biocompatibilità dei sostituti cardiaci. La prima generazione di HM, basata su DBP e poliuretano, ha dimostrato la sua idoneità per il rivestimento interno dei TAH. La funzionalizzazione covalente e selettiva di DBP con 10-5 M di REDV ha provato la sua efficacia nell’accelerare l’adesione e proliferazione endoteliale. Un protocollo più conservativo e citocompatibile per la decellularizzazione del cuore totale è stato sviluppato e ha determinato la completa rimozione delle cellule endogene, preservando la matrice cardiaca.