SERPINB3 inibisce il poro di transizione della permeabilità mitocondriale attraverso la regolazione della produzione di ROS mitocondriali e incrementa la resistenza ai trattamenti chemioterapici

Resistance to chemotherapeutic agents is well known in patients with hepatocarcinoma. Inhibition of the mitochondrial permeability transition pore (PTP) is a crucial step in tumor cell resistance to apoptosis induced by anticancer drugs. Since SERPINB3 is overexpressed in hepatocellular carcinoma and has an anti-apoptotic activity, aim of the study was to assess the role of this serpin on PTP modulation during treatment with chemotherapeutic agents. HepG2 cells stably transfected with SERPINB3 where assayed for cell death induced by Cisplatin, Doxorubicin, Etoposide and 5-Fluorine Uracil. Reactive Oxygen Species (ROS) were detected with dichlorofluorescein. Threshold of PTP opening was evaluated by CRC assay and Complex I activity was determined by spectrophotometric assay. After cell death induction by Cisplatin and Doxorubicin, HepG2 cells expressing SERPINB3 showed a significant increase in viability compared to controls, while there was no difference in cell death after Etoposide and 5-FU treatments. The addition of the antioxidant N-acetyl cysteine abrogated cell death induction by Cisplatin and Doxorubicin, suggesting that SERPINB3 protects from death through an antioxidant activity. Since Cisplatin and Doxorubicin induce mitochondrial oxidative stress and favor PTP opening, cells were treated with the PTP inducer EM20-25 that acts at mitochondrial level. In presence of SERPINB3 the effect of EM20-25 resulted in PTP opening inhibition and decreased ROS formation. Subcellular localization analysis revealed that a fraction of SERPINB3 was located in mitochondria and that it increased after death-promoting treatments. Mitochondrial SERPINB3 was found associated to respiratory chain Complex I by immunoprecipitation experiments. In vitro analysis confirmed the inhibition by SERPINB3 of Complex I activity, known as one of the main sources of mitochondrial ROS. In conclusion, SERPINB3 acts at mitochondrial level protecting cells from chemotherapeutic-induced oxidative stress and consequent cell death. This antioxidant function could represent a relevant advantage for a transformed cell to balance its ROS equilibrium and for SB3-expressing cells exposed to anticancer treatments.

L'epatocarcinoma (HCC) è la quinta forma di cancro più diffusa nel mondo ed è caratterizzato da un'alta proliferazione cellulare e da un'alta resistenza ai trattamenti chemioterapici. Negli ultimi anni l'associazione tra la ov-serpina SERPINB3 (precedentemente conosciuta anche come SCCA1) e la progressione della patologia epatica e lo sviluppo di HCC si è fatta sempre più stretta, portando ad ipotizzare che questa proteina possa giocare un ruolo importante nella biologia del tumore epatico. SERPINB3 è in grado di inibire la morte cellulare in sistemi cellulari di tipo epiteliale, ma non si conosce ancora il suo esatto meccanismo d'azione molecolare né la sua funzione nel fegato. Lo scopo dello studio è stato verificare il ruolo di SERPINB3 nella morte cellulare indotta da trattamenti chemioterapici in un modelli epatici sperimentali e di indagarne l'azione a livello molecolare. Esprimendo SERPINB3 in una linea di epatoma (HepG2), si è messo in evidenza come la presenza della proteina riduce la morte cellulare dopo trattamento con Cisplatino e Doxorubicina, ma non dopo trattamento con Etoposide o 5-FluoroUracile. Esperimenti successivi hanno documentato come la resistenza alla morte sia associata ad un diminuito stress ossidativo, definito come riduzione dei livelli di ROS, nelle cellule che esprimono SERPINB3. E' stato dimostrato che la diminuzione dei livelli di ROS si associa alla presenza di SERPINB3 a livello mitocondriale. Utilizzando l'EM20-25, un composto che fa parte della famiglia dei chemioterapici BH3-mimetici, è stato confermato che la protezione viene conferita a livello mitocondriale in quanto viene diminuita l'attività del Complesso I della catena respiratoria con conseguente diminuzione dei livelli di ROS. Questo meccanismo molecolare è stato confermato mediante la documentazione dell'inibizione del Poro di Transizione di Permeabilità mitocondriale da parte di SERPINB3, che è considerato un regolatore chiave dell'innesco della morte cellulare. Dato che SERPINB3 non è presente nel fegato sano, ma la sua espressione progressivamente aumenta in corso di infiammazione cronica e di cirrosi, la sua azione antiossidante, inizialmente protettiva, potrebbe contribuire alla sopravvivenza di cellule trasformate e allo sviluppo di tumore. Nell'ambito dell'epatocarcinoma SERPINB3 potrebbe contribuire alla resistenza ai trattamenti chemioterapici, nota caratteristica di questa forma tumorale epatica.