Ingegnerizzazione della proteina di matrice M1 del virus dell'influenza per la produzione di virus-like particles (VLPs) a scopo vaccinale

Influenza viruses represent a significant public health problem, since they are the etiological agents of acute respiratory illness that can occur in annual epidemics or in occasionally pandemic events. Influenza viruses constantly evolve by the accumulation of point mutations at the level of their antigenic determinants hemagglutinin and neuraminidase (antigenic drift), or as a result of a genetic reassortment (antigenic shift), usually happening when avian and human viruses co-infect an intermediate host. The high rate of mutations, the possibility of reassortment of gene segments and the wide variety of influenza viruses explain their ability to overcome the host immunity, acquired by previously vaccination (Wong et al., 2005). Moreover, the difficulty of developing vaccines capable of inducing a long-lasting immune response leads to the need of up-dating the vaccine formulation every year (Wong et al., 2005). On the other hand, molecular evolution processes determine an increasing emergence of drug-resistant viruses that restrict the efficacy of the antiviral drugs. Indeed, vaccination remains the most effective preventative strategy to reduce the chance of infection from influenza virus and its complications. In this context, vaccines based on virus-like particles (VLPs) are extremely promising. In fact VLPs, while being antigenically identical to the infectious virus, lack pathogenicity. VLPs are obtained by expressing specific viral structural proteins, that display the ability to bud from cells, in the absence of any other viral component (such as retroviral Gag and papillomavirus L1) (Zeltins, 2013). VLPs can be used per se or as “platforms” for the presentation of immunodominant epitopes. In the case of influenza viruses, the matrix protein M1 represents the major driving force of viral budding process (Gomez-Puertas et al., 2000). However, the expression of M1 alone does not allow the production of VLPs. Among other reasons, this feature is due to the lack in M1 of a membrane targeting signal (Wang et al., 2010a). In this context, during the viral infection, it is the second matrix protein, M2, which is charachterized by a targeting signal and can physically interact with M1, that brings the latest in contact with the plasma membrane (Chen et al., 2008). Moreover, M2 is also able to facilitate the curvature of the membrane and the scission of the envelope of the budding viral particle from the cell surface (Rossman et al., 2010), a function that is linked to the cellular complex ESCRT (endosomal sorting complex required for transport)-III, in the case of most enveloped viruses (Calistri et al., 2009b). The overall aim of our work was to optimize the production of influenza VLPs based on M1, by identifying the minimal sequences requested to render M1 able to bud independently from M2 co-expression. To this end, we created different recombinant M1 proteins characterized by the ability to interact with different ESCRT components and to directly contact the plasma membrane, in the absence of M2. Specifically, we generated constructs expressing M1 fused to the myristilation signal of HIV-1 Gag and containing short proline rich domains (Ldomains) capable of interacting with either Tsg101 (PTAP), AIP1/Alix (YPDL), both cellular proteins able to interact with ESCRT-III and involved in the budding of several RNA enveloped viruses (Calistri et al., 2009b), or to a motif (PTAPPEY) known to be extremely efficient in mediating the production of VLPs (Strack et al., 2000). Moreover, we directly fused at the C-terminus of M1 specific ESCRT-III proteins, namely CHMP3 and CHMP4B. In this way, we were able to demonstrated that: i) the HIV-1 Gag myristilation signal, added to the N-terminus of M1 (Myr-M1), confers it the ability to contact the plasma membrane; ii) the insertion of the small proline rich domain PTAP allows Myr-M1 to form VLPs and iii) the fusion between M1 and the cellular protein CHMP4B allows M1 to bud from the cells, independently from the presence of the myristilation signal. Furthermore, we were able to demonstrated that M2 alone and the M2-M1 fusion protein can self-assemble and bud into virus-like particles. In this context, by engineering specific mutants of the Gag proteins of the feline immunodeficiency virus (FIV), previously described in our laboratory (Calistri et al., 2009a), we were able to demonstrated that indeed M2, and in particular its cytoplasmic region, can act as a substitute of ESCRT-III components for the budding of the influenza virus. Finally, VLPs based on M2, M2-M1 and M1-Myr-CHMP4B, were used in a pilot experiment performed in mice, in order to analyze their immunogenicity. Interestingly, we were able to detected specific antibodies directed against the protein M1, even though in a small number of tested animals. However, the obtained data are encouraging, since the purification of the employed VLPs, which are still under characterization in terms of density and morphology, was not optimal, thus affecting the obtained results. Finally, we also generated different hemagglutinin (HA) mutants characterized by the absence of the globular head (headless-HA). Indeed, it is well known that the conserved stalk domain of influenza HA is highly immunogenic and confers a broadly immune response (Steel et al., 2010). We demonstrated that headless HA can be incorporated into engineered VLPs, based on FIV Gag protein. Currently, we are analyzing the possibility of incorporating headless-HA protein also in M1-based VLPs. Next, after setting up the appropriate purification protocol, we would test these M1- based VLPs, together with the FIV-based one, in the mouse model. In conclusion, overall our data provide on one hand important biological insights into the function/characteristics of the influenza virus M1 and M2 proteins and, on the other hand useful information for the development and improvement of influenza-based VLPs to be employed in vaccination strategies.

I virus dell’influenza costituiscono un rilevante problema di sanità pubblica a livello mondiale, in quanto sono gli agenti eziologici di patologie respiratorie acute che si possono presentare sotto forma di epidemie annuali, oppure come pandemie occasionali. Questi virus evolvono costantemente mediante l’accumulo di mutazioni puntiformi a carico degli antigeni di superficie emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) (antigenic drift), oppure in seguito a fenomeni di riassortimento genico (antigenic shift) derivanti dalla coinfezione di virus aviari ed umani in un ospite intermedio. L’alto tasso di mutazioni, la possibilità di riassortimento dei segmenti genici e l’ampia varietà di virus dell’influenza spiegano la capacità di questi virus di superare le barriere anticorpali indotte da immunità pregresse (Wong et al., 2005). Inoltre, l’alta variabilità del virus dell’influenza limita anche l’efficacia della terapia antivirale a disposizione a causa dei frequenti fenomeni di farmaco-resistenza. La vaccinazione rappresenta, quindi, la miglior strategia per prevenire e ridurre le possibilità di infezione da parte del virus dell’influenza e le conseguenti complicazioni. Tuttavia, le strategie per lo sviluppo di vaccini efficaci, capaci di stimolare immunità di lunga durata, sono risultate vane ad oggi, determinando quindi la necessità di cambiare ogni anno la formulazione del vaccino influenzale (Wong et al., 2005). Per questo motivo, sono allo studio nuovi approcci vaccinali che consentano di ottenere, una volta inoculati nell’uomo, una protezione prolungata e diretta contro diversi sottotipi influenzali (vaccini universali). Inoltre, si cerca di migliorare l’efficacia e la rapidità delle procedure produttive dei vaccini classici, in maniera da poter affrontare, se necessario, emergenze quali l’insorgenza di ceppi influenzali pandemici (Kang et al., 2011). Una tecnica molto promettente, da entrambi i punti di vista, risulta essere quella basata sulla produzione di particelle simil-virali o Virus-like particles (VLP). Le VLP mimano strutturalmente la particella virale, ma mancano della capacità replicativa, poichè prive del genoma virale (Zeltins, 2013). Le particelle simil-virali possono essere ottenute mediante l’espressione delle proteine strutturali virali (es.: Gag dei retrovirus, L1 di HPV), le quali hanno la capacità intrinseca di autoassemblarsi e gemmare dalle cellule (Haynes, 2009). Inoltre, le VLP posso essere utilizzate anche come piattaforme per la presentazione di epitopi, anche eterologhi, immunodominanti. La proteina di matrice M1 rappresenta la driving force della fase di gemmazione del virus dell’influenza (Gomez-Puertas et al., 2000). La sua espressione nelle cellule, tuttavia, non è sufficiente a determinare la produzione di VLP. Questo dipende da diverse ragioni, tra le quali l’incapacità di M1 di contattare da sola la membrana plasmatica, a causa della mancanza di un segnale specifico di indirizzamento (Wang et al., 2010a). A questo proposito, è stato dimostrato come un’altra proteina strutturale virale, M2, svolga un ruolo importante nelle ultime fasi del processo di gemmazione virale, mediando proprio l’interazione tra M1 e la membrana plasmatica (Chen et al., 2008). Inoltre, è stato recentemente chiarito che la capacità del virus dell’influenza di gemmare dalle cellule infettate in assenza del pathway di biogenesi dei Multivescicular Bodies (MVB), funzionale, utilizzato invece dalla maggior parte dei virus ad RNA dotati di envelope, sia da ascrivere proprio a funzioni intrinseche di M2. In particolare, M2 sarebbe in grado di funzionare come sostituto delle proteine appartenenti al complesso ESCRT (endosomal sorting complex required for transport)-III, fondamentale nell’ambito della formazione dei MVB e nella gemmazione di molti virus a RNA (Rossman et al., 2010). Scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di conferire ad M1 le minime caratteristiche necessarie per gemmare da cellule eucariotiche anche in assenza di altri componenti virali. A tale scopo, M1 è stata opportunamente ingegnerizzata attraverso la fusione di domini, porzioni o intere proteine eterologhe, al fine di conferirle la capacità di contattare autonomamente la membrana cellulare e di sfruttare ESCRT-III. Il presente lavoro di dottorato si propone quindi l’ottimizzazione della produzione di VLP del virus dell’influenza come piattaforma per lo sviluppo di un vaccino universale. In particolare, l’attenzione è stata focalizzata sulla proteina di matrice M1 e sulla possibilità di renderla indipendente dalla proteina M2 durante la fase di gemmazione. È stato possibile quindi dimostrare: i) che il segnale di miristilazione della proteina Gag del virus dell’immunodeficienza umana (HIV-1), fuso nella regione amminoterminale di M1 (Myr-M1), le conferisce la capacità di contattare la membrana plasmatica, ii) che l’aggiunta di un piccolo dominio ricco in prolina (PTAP), noto in letteratura come in grado di mediare l’interazione tra proteine diverse e il pathway di biogenesi dei MVB, consente ad Myr-M1 di gemmare nel sovratante cellulare; iii) che la fusione tra M1 e la proteina cellulare CHMP4B, appartenente al complesso ESCRT-III consente ad M1 di fuoriuscire dalle cellule, indipendentemente dalla presenza del segnale di miristilazione. Inoltre, abbiamo dimostrato che la proteina di fusione M2-M1 è in grado di gemmare autonomamente dalle cellule, così come la sola M2. Infine, le VLP basate su M2, M2-M1 e Myr-M1-CHMP4B sono state utilizzate in un esperimento pilota, eseguito nel topo, al fine di analizzarne l’immunogenicità in vivo. Nonostante siano stati rilevati anticorpi specifici e diretti contro la proteina M1 in un numero statisticamente non significativo di topi saggiati, i dati ottenuti in questo esperimento pilota risultano essere incoraggianti. Infatti, sono stati raggiunti utilizzando VLP prodotte in condizioni di purificazione ancora da ottimizzare. Partendo da questi dati, abbiamo anche generato una serie di costrutti codificanti diversi mutanti della proteina di superficie del virus influenzale HA, accomunati dall’assenza di uno dei suoi domini, ovvero dalla parte globulare (HA-headless). E’ stato, infatti, dimostrato che HA-headless, a differenza della forma wild-type della proteina, è caratterizzata dall’esposizione al sistema immunitario di epitopi altamente conservati e, quindi, rappresenta un’ottima base per lo sviluppo di un vaccino universale, in grado di stimolare la risposta immunitaria verso ceppi virali diversi. Abbiamo analizzato e dimostrato la possibilità di incorporare HAheadless in particelle simil-virali basate sull’espressione della proteina Gag del virus dell’immunodeficienza felina (FIV). Intendiamo ora valutare la possibilità di incorporare HA-headless anche nelle VLP basate su M1 ingegnerizzata e, dopo opportuna purificazione, testare queste ultime e le VLP basate su FIV nel modello murino. In ultimo, al fine di approfondire il ruolo svolto da M2 come sostituta di ESCRT-III nell’ambito della gemmazione del virus dell’influenza, sono stati generati costrutti specifici basati sulla proteina strutturale Gag di FIV, mutata a livello delle sequenze che il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato essere essenziali per il reclutamento del pathway di biogenesi degli MVB e per la gemmazione di FIV (Calistri et al., 2009a). I risultati ottenuti suggeriscono che la regione della coda citoplasmatica di M2 è in grado di ripristinare la gemmazione dei mutanti virali. In conclusione, i dati ottenuti in questa tesi di dottorato non solo forniscono importanti informazioni biologiche, relative alle funzioni di due proteine del virus dell’influenza (M1 e M2) e del coinvolgimento di proteine cellulari in fasi essenziali del ciclo replicativo virale, ma pongono interessanti basi per lo sviluppo di nuove strategie vaccinali dirette contro il virus dell’influenza basate su VLP.