Skeletal muscle reconstruction through in vivo tissue engineering and characterization of satellite cell heterogeneity

One of the most exciting challenges in tissue engineering is the complete reconstruction of an organ, with all its components. This depends on finding the most effective combination of stem cells and a biocompatible scaffold, able to support cell proliferation and differentiation, other than a physical structure. During my PhD study, I investigated about the possibility to reconstruct a muscle after severe ablation, and I designed and developed an experimental protocol for the delivery of either muscle progenitor cells (MPCs) or SCs via an injectable and in situ photo-crosslinkable hyaluronan-based hydrogel (HA-PI). Engrafting partially ablated tibialis anterioris (TA) muscles of C57BL/6J mice with freshly isolated GFP+ SCs embedded in hydrogel, I found a huge recovery of muscle mass, when compared to TAs receiving hydrogel+MPCs or hydrogel alone. Moreover, freshly isolated SCs embedded in HA-PI were also able to promote functional recovery, as monitored by contractile force measurements. The latter was associated with generation of both neural and vascular networks and the reconstitution of a functional satellite cell niche. This work constitutes the first realization of an in vivo tissue engineering approach, that hopefully would overcome previous limitations in skeletal muscle tissue engineering. Following these results, I also focused on finding a subpopulation of SCs, endowed with great capacity of proliferation and migration in the host muscle, and able to promote the best regeneration after damage. SCs were initially considered unipotent stem cells with the ability of generating a unique specialized phenotype. Subsequently, it was demonstrated in mice that opposite differentiation towards osteogenic and adipogenic pathways was also possible. Even though the pool of SCs has been accepted as the major, and possibly the only, source of myonuclei in postnatal muscle, it is likely that SCs are not all multipotent stem cells and evidences for diversities within the myogenic compartment have been described both in vitro and in vivo. In my study, by isolating single fibers from rat flexor digitorum brevis (FDB) muscle, I was able to identify and clonally characterize two main subpopulations of SCs: the low proliferative clones (LPC) present in major proportion (~75%) and the high proliferative clones (HPC), present instead in minor amount (~25%). LPC spontaneously generated myotubes whilst HPC differentiated into adipocytes even though might skip the adipogenic program if co-cultured with LPC. LPC and HPC differed also for mitochondrial membrane potential (ΔΨm), ATP balance and Reactive Oxygen Species (ROS) generation underlying diversities in metabolism that preceded differentiation. Notably, SCs heterogeneity was retained in vivo. I could conclude that SCs may therefore comprise of two distinct, though not irreversibly committed, populations of cells distinguishable for prominent differences in basal biological features such as proliferation, metabolism and differentiation.

Una delle sfide più intriganti nell’ambito dell’ingegneria tissutale è la ricostruzione completa di un organo. Questa dipende dal trovare la combinazione più efficace tra cellule staminali e uno scaffold biocompatibile, in grado di fornire supporto per la proliferazione e la migrazione cellulare, oltre ad una struttura fisica. Durante i miei studi per il dottorato di ricerca mi sono concentrato specificamente nella ricostruzione del muscolo in seguito ad una consistente rimozione di tessuto, e ho disegnato e sviluppato un protocollo sperimentale sia per l’impianto di cellule precursori muscolari (MPCs) che di cellule satelliti (SCs) attraverso un idrogel a base di acido ialuronico iniettabile e fotopolimerizzabile in situ. Impiantando muscoli tibialis anterioris (TA), parzialmente ablati, di topi C57BL/6J con SCs isolate a fresco e GFP-positive, inserite in idrogel, ho potuto documentare un consistente recupero di massa muscolare, se paragonato a TAs che avevano ricevuto idrogel+MPCs o il solo idrogel. Inoltre le SCs isolate a fresco e inserite in idrogel hanno portato ad un recupero funzionale, monitorato attraverso misurazione della forza contrattile. Questo recupero è stato associato alla generazione sia di un network neurale che vascolare e alla ricostituzione di una nicchia di SCs funzionale. Questo lavoro costituisce la prima realizzazione di un approccio di ingegneria tissutale in vivo, con le potenzialità per superare le limitazioni incontrate in precedenza nell’ingegnerizzazione del tessuto muscolare. In seguito a questi risultati mi sono focalizzato nella caratterizzazione di una sottopopolazione di SCs, con elevata capacità proliferativa e di migrazione nel muscolo ricevente, nonché in grado di promuovere una efficace rigenerazione in seguito a danno. Le SCs sono state inizialmente considerate cellule staminali unipotenti, in grado cioé di dare origine ad un unico fenotipo specializzato. In seguito è stato dimostrato in topo come anche il differenziamento in senso alternativo verso le pathways osteogenica e adipogenica fosse possibile. Anche se si conviene che la popolazione delle SCs sia la maggiore, e probabilmente l’unica fonte di mionuclei per il muscolo, è verosimile che le cellule satelliti non siano tutte cellule staminali multipotenti, in quanto evidenze di diversità all’interno del compartimento miogenico sono state descritte sia in vitro che in vivo. Nel mio studio, attraverso l’isolamento di singole fibre da muscolo flexor digitorum brevis (FDB) di ratto, ho potuto identificare e caratterizzare clonalmente due principali sottopopolazioni di SCs: i cloni a bassa proliferazione (LPC), presenti in proporzione maggiore (~75%), e i cloni ad alta proliferazione (HPC), presenti invece in minor quantità (~25%). I LPC generano spontaneamente miotubi mentre i HPC differenziano in adipociti, con la proprietà di skippare il programma adipogenico se messi in co-coltura con LPC. LPC e HPC differiscono anche per il potenziale di membrana (ΔΨm), il bilancio dell’ATP e la generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), mettendo in evidenza diversità nel metabolismo che precedono il differenziamento. Inoltre l’eterogeneità delle SCs è mantenuta anche in vivo. Posso così concludere che il pool delle SCs sembra comprendere due popolazioni cellulari distinte, anche se non irreversibilmente determinate, distinguibili in base a notevoli differenze riguardo a parametri biologici basali, come proliferazione, metabolismo e differenziamento.