Riprogrammazione di preadipociti umani mediante trattamento chimico

Recent studies have shown that differentiated mammalian cells may de-differentiate by forced expression of defined factors for pluripotency; biomedical research is seeking optimizing techniques for obtaining iPS cells without the use of viral genetic material. The purpose of this work was to obtain iPS cells virus-free using the strategy work proposed below: - Extraction of precursors from adipose tissue of healthy subject and cultured in Preadipocyte Growth Medium or in DMEM added with 10% FCS. - Characterization of these cells by research of specific nuclear, cytoplasmic and surface markers; for this purpose it has been invoked in a series of methods including flow cytometry analysis, molecular and cytochemical (immunofluorescence, Oil Red O) essays; - Treatment of cells with 5-azacitidine 10 μM for 48-96 hours; - Performing tests of cell viability (MTT) and daily observation by light microscopy at to monitor the morphology and growth of cells treated with azacitidine. - Real Time PCR order to characterize the cells "reprogrammed" to molecular level, or to check the over-expression of stem cells genes (OCT-4, Nanog, Sox-2) and the down-regulation of tissue-specific genes. - Evaluation of the expression of transcription factors stem cells specific through Western blot analysis. - Analysis by confocal microscopy and cytometry to define the characteristics morphological and phenotypic of cells treated with demethylating agent and "reprogrammed".

Recenti studi hanno dimostrato che cellule di mammifero differenziate possono de-differenziarsi mediante espressione forzata di definiti fattori per la pluripotenza; la ricerca biomedica sta cercando di ottimizzare le tecniche per l'ottenimento di cellule iPS senza l'uso di materiale genetico virale. Scopo di questo lavoro è stato quello di ottenere cellule iPS virus-free utilizzando la strategia di lavoro proposta di seguito: -Estrazione di precursori da tessuto adiposo di soggetto sano e coltura delle stesse in Preadipocyte Growth Medium o in DMEM addizionato con FCS al 10%. -Caratterizzazione delle stesse cellule mediante ricerca di specifici marcatori nucleari, citoplasmatici e di superficie; a tale scopo ci si è avvalsi di una serie di metodiche tra cui l’analisi citofluorimetrica, saggi citochimici (immunofluorescenza, Oil Red O) e molecolari; -Trattamento delle cellule con 5-azacitidina 10 μM per 48-96 ore; -Esecuzione di saggi di vitalità cellulare (MTT) e osservazione giornaliera mediante microscopia ottica allo scopo di monitorare la morfologia e la crescita delle cellule trattate con azacitidina. -Realizzazione di indagini di Real Time PCR allo scopo di caratterizzare le cellule “riprogrammate” a livello molecolare, ovvero per verificare la sovra-espressione di geni indicatori di staminalità (OCT-4, Nanog, Sox-2) e la down-regolazione di geni tessuto specifici. -Valutazione dell’espressione di fattori di trascrizione specifici delle cellule staminali mediante analisi Western Blot. -Analisi mediante microscopia confocale e citofluorimetria per la definizione delle caratteristiche morfologiche e fenotipiche delle cellule trattate con l’agente demetilante e “riprogrammate”.