Replication dynamics at common fragile site FRA6E (6q26)

Summary Fragile sites are non-random chromosomal regions prone to breakage, which are expressed as decondensations, gaps or breaks under conditions in which DNA synthesis is partially inhibited. It has been hypothesised that they could represent uncondensed regions of the chromosome, for example due to unreplicated or single-stranded DNA. Moreover, there is some evidences that these loci are involved in chromosomal rearrangements related to tumours (Arlt et al., 2003). Depending on the frequency of expression in the population and on their inheritance pattern, these regions can be classified in two main categories: rare and common fragile sites. Rare fragile sites occur in less than 5% of the human population and they are characterized by the presence of di- o trinucleotide repeats (CGG(n) e AT (n)). The rare fragile site expression, segregating as mendelian traits, can be associated with pathological phenotypes. In most of the cases breakages at these sites are due to nucleotide repeat expansions, as occur in the fragile X syndrome. The major group of rare fragile sites is folate-sensitive in vitro, a vitamin involved in the nucleotides biosynthesis, and it can be hypothesized that alterations on the DNA replication can cause the fragility expression within these regions Common fragile sites (CFS) are thought to be a normal feature of chromosomes and they show an high structural instability as a consequence of a replication stress. These sequences are seen in all individuals, although their expression vary and it is visible only in a subset of cells. CFS are characterised by the presence of AT-rich sequences and show several features of unstable DNA: high frequency of deletions, translocations, hotspots for sister chromatid exchanges (SCE). Moreover, these sites usually span along very large genomic regions and they contain large genes, presenting long intronic sequences (Glover et al., 2005), as demonstrated for FHIT, WWOX and PARK2 located in FRA3B. FRA16D and FRA6E, respectively. Some of them were found to function as tumour suppressor genes (Schwartz et al., 2005) and this evidence supports the hypothesis that the genomic instability can play a role in cancer development. It has been demonstrated that common fragile sites are late replicating regions, as reported for FRA3B (Le Beau et al., 1998), and the presence of double strand breaks at these sites can appear as a consequence of stalled or collapsed replication forks. In this study, analysis were focused on common fragile site FRA6E, one of the most frequently CFS expressed in humans. It is located on chromosome 6 (q26) in a susceptibility region frequently found rearranged in cancer. Many genes are located within FRA6E and some of them presented long intronic sequences, as ARID1B and PARK2. Concerning the last one, a putative role of oncosuppressor gene has been suggested. Previous data obtained in our laboratory indicated that FRA6E is a large genomic region of instability, spanning approximately 9 Mb (Russo et al., 2006) and it can be sub-divided in three sub-regions, depending on the flexibility features: the central sub-region is less fragile than the centromeric one, where ARID1B gene is mapping, and than the telomeric one, where PARK2 gene is located. The aim of this study was to investigate if FRA6E instability could be related to replication defects at this site. Analysis were performed by using an innovative technique, the molecular combing, which allows the uniform elongation of single DNA molecules on silanised glass surfaces, leading to the defined equivalence of 1 ?m = 2 kb. Combining FISH, with specific probes, and immunodetection of replicating DNA on single molecules, it is possible evaluate the replication pattern at specific regions. The first phase of the project consisted in setting up the molecular combing and other related experimental procedures. The second part of the project was focused on the study of the replication pattern of FRA6E, compared to other two regions: the common fragile site FRA3B and the HPRT locus, as a control region. Concerning FRA6E, the two more fragile regions were considered, where ARID1B and PARK2 genes are located, whereas in FRA3B, the most expressed common fragile site in humans, the core of fragility was analysed, where FHIT gene is mapping. In order to evaluate the replication pattern at high resolution we used human primary lymphocytes, isolated from two different donors. For each region, genomic clones were selected by bioinformatics analysis, to be employed as probes in FISH experiments on combed DNA. We focused the analyses in order to map replication origins, to determine fork density, replication rates and deregulative events (unidirectional forks, fork arrest events and asynchronous forks) . Data collected showed that the mean fork rates seemed to be similar among the regions. In FRA6E the mean fork rates were higher in ARID1B than in PARK2 region, even if they can not be considered significantly different when compared to published data relative to the whole genome (Conti et al., 2007). Looking at the distribution of fork rate values, in ARID1B we noticed a lower variability than in PARK2, and notably forks have been detected on a 200 kb sub-region. The frequency of unidirectional events was found to be more homogeneous and higher among FRA6E-PARK2 and FRA3B-FHIT than FRA6E-ARID1B and HPRT. Also active origins were mapped and the inter-origin distances were evaluated, obtaining mean values in agreement with already published data (Conti et al., 2007). Moreover, in order to better understand in which way stress conditions can influence the replication process into the fragile regions, cells were treated with aphidicolin (APH), an inhibitor of the DNA polymerase, at different doses and times. Initially, we verified that the high concentration APH resulted in accumulation of cells in S phase after 24 h of treatment, whereas the cell cycle progression seemed not significantly modified at the other tested conditions. Analyses at whole genome level performed by molecular combing indicated a strong delaying effect on the replication process after 2 h of treatment, with a strong decrease of the mean fork speed. We also analysed the replication pattern at FRA3B-FHIT, FRA6E-PARK2 and HPRT loci by FISH on interphase nuclei of APH-treated and control cells. APH treatment was found to be effective in slowing replication process, with different extent with respect to the locus considered. Single locus analysis on APH treated combed DNA, carried out to evaluate the replication pattern of FRA6E-PARK2 and HPRT locus, showed that the mean fork speed in both regions strongly decreased, if compared to the controls, in agreement with the data obtained at whole genome level. At both loci unidirectional forks were found to increase with respect to the controls. Also in this case the inter-origin distances ware evaluated and they were found to be differently affected from APH treatment in HPRT region than in PARK2. Infact, in HPRT the replication stress induced the activation of replication origins that seemed to be inactive in control condition, correlated to a reduced interorigin distance, whereas in PARK2 region the effect of the APH treatment was a strong inactivation of the replication origins. In order to study the replication of these regions specifically during the S phase, we performed the Centrifugal Elutriation, to obtain synchronous cell sub-populations without any chemical or drug treatments, which may interfere with the fragile site expression. These experiments were performed by using lymphoblastoid cell lines, because the method cannot be used with primary lymphocytes. The achievement of enriched S-phase cell sub-populations will be useful to extend the analyses to the replication process at common fragile sites during the late S-phase, in order to better understand the response to stress conditions.

Riassunto I siti fragili sono regioni instabili del genoma umano che mostrano una tendenza preferenziale a formare rotture cromosomiche o gap acromatici, visibili in cromosomi di cellule esposte, in coltura, a parziale inibizione della replicazione del DNA. Data la modalità di induzione, si ritiene che queste regioni siano costituite da DNA non replicato, formatosi in seguito allo stallo delle forche replicative. La presenza di DNA a singolo filamento può portare, quindi, alla formazione di rotture cromosomiche. L’instabilità a livello di questi siti è stata correlata alla formazione e allo sviluppo di diverse forme tumorali (Arlt et al., 2003). In base alla frequenza di espressione all’interno della popolazione umana, i siti fragili vengono suddivisi in due categorie: i siti fragili rari e i siti fragili comuni. I siti fragili rari, espressi in circa il 5% della popolazione umana, sono caratterizzati dalla presenza di ripetizioni di- o tri- nucleotidiche (CGG(n) e AT (n)). L’espressione dei siti fragili rari, ereditati con modalità mendeliana, è direttamente associata all’espansione degli elementi ripetuti che li caratterizzano. Il meccanismo è alla base di diverse patologie associate alle mutazioni dinamiche, di cui la sindrome dell’X fragile è un esempio. Invece i siti fragili comuni (CFS) sono sequenze costitutive dei cromosomi che presentano un’elevata instabilità strutturale espressa in vitro in condizioni di stress replicativo. Essendo una componente normale della struttura cromosomica, i CFS sono virtualmente espressi in tutti gli individui, anche se non con la stessa frequenza. Sono regioni ricche in AT e siti preferenziali di riarrangiamento, amplificazione genica, rotture cromosomiche. Essi occupano regioni molto ampie nel genoma, dell’ordine delle Mb, e presentano spesso al loro interno grandi geni con sequenze introniche molto lunghe (Glover et al., 2005), come ad esempio FHIT, WWOX e PARK2 presenti rispettivamente in FRA3B, FRA16D e FRA6E. Per alcuni di questi geni, inoltre, è stato dimostrato il ruolo di oncosoppressore (Schwartz et al., 2005). Dai dati presenti in letteratura, è noto che la replicazione dei siti fragili comuni avviene tardivamente all’interno della fase S (Le Beau et al., 1998), e si ritiene, quindi, che la formazione di rotture a doppio filamento in questi siti sia la conseguenza dello stallo delle forche replicative, riconducibile ad una perturbazione del processo replicativo. In questo studio, l’attenzione è stata focalizzata sul sito fragile comune FRA6E, il terzo CFS maggiormente espresso nella popolazione umana. FRA6E mappa sul cromosoma 6, in posizione q26, in una regione che presenta un’alta frequenza di riarrangiamenti in diversi tipi di tumori. All’interno di questo sito fragile comune mappano diversi geni ed alcuni di essi presentano lunghe sequenze introniche, come ad esempio ARID1B e PARK2; per quest’ultimo si suppone un ruolo di oncosoppressore. Nel laboratorio in cui ho lavorato, è stato dimostrato in precedenza che FRA6E si estende per circa 9 Mb (Russo et al., 2006) e può essere suddiviso in tre sottoregioni, in base al suo differente pattern di fragilità: la sottoregione centrale è meno fragile rispetto a quella centromerica, in cui mappa il gene ARID1B e a quella telomerica, in cui mappa PARK2. Lo scopo principale di questo progetto è stato quello di indagare se l’instabilità del sito fragile comune FRA6E può essere correlata a difetti nella sua replicazione. Lo studio della replicazione è stato effettuato grazie all’utilizzo di una tecnica innovativa, il molecular combing, che permette un’analisi molecolare ad alta risoluzione, in quanto le singole molecole di DNA vengono elongate in maniera uniforme su di un vetrino funzionalizzato. Per le molecole distese si ottiene la relazione 1 ?m = 2 Kb, e questo permette di effettuare delle misurazioni molto accurate. Combinando l’ibridazione di sonde specifiche, che permettono di visualizzare le regioni di interesse, è possibile valutarne il pattern replicativo, rilevando mediante immunofluorescenza il DNA in replicazione: infatti le cellule sono state marcate con due pulse consecutivi di analoghi di nucleotidi. La prima fase del progetto ha previsto la messa a punto del protocollo del molecular combing e delle varie procedure inerenti, in modo tale da poterla applicare efficacemente al nostro studio. La seconda fase del progetto si è focalizzata sull’analisi del pattern replicativo del sito fragile comune FRA6E, in relazione ad altre due regioni: il ben caratterizzato sito fragile comune FRA3B e il locus HPRT, utilizzato come regione di controllo. Per quanto riguarda FRA6E mi sono concentrata sullo studio della replicazione nelle due regioni di maggiore fragilità, dove mappano i geni ARID1B e PARK2, mentre per quanto riguarda FRA3B ho analizzato il core di fragilità, dove mappa il gene FHIT. Per condurre le analisi ad alta risoluzione del pattern replicativo delle diverse regioni di interesse sono stati utilizzati linfociti primari, estratti da sangue di due diversi donatori. Per ogni regione sono stati inoltre selezionati, attraverso analisi bioinformatiche, set di cloni genomici, da poter impiegare come sonde negli esperimenti di FISH su DNA elongato. Per descrivere le dinamiche di replicazione di ogni locus sono state determinati la velocità media delle forche replicative e gli eventuali eventi deregolativi (forche unidirezionali, eventi di arresto e asincronia nella velocità di progressione); è stata inoltre effettuata la mappatura delle origini di replicazione. I dati ottenuti suggeriscono che le velocità medie delle forche replicative sono simili in tutte le regioni analizzate. Tuttavia in FRA6E, la velocità media è più alta nella regione dove mappa il gene ARID1B rispetto a quella dove mappa PARK2, pur essendo entrambe in accordo con i dati pubblicati a livello dell’intero genoma (Conti et al., 2007). Inoltre, analizzando la distribuzione dei valori relativi alle velocità, rispetto a PARK2 la regione di ARID1B mostra una minore variabilità: infatti, la maggior parte delle osservazioni si collocano in una sottoregione di 200 Kb. Questa regione ha tutte le caratteristiche tipiche di una sequenza a replicazione tardiva. Nelle regioni di FRA6E-PARK2 e di FRA3B-FHIT la frequenza delle forche unidirezionali è risultata più elevata rispetto a quella osservata nelle regioni di FRA6E-ARID1B e HPRT. Inoltre, sono state mappate le posizioni delle origini attive di replicazione nelle varie regioni e sono state stimate le relative distanze, le quali risultano essere in accordo con i dati già pubblicati (Conti et al., 2007). Per determinare come l’induzione dello stress replicativo influisca sulla replicazione a livello delle regioni fragili, sono state stimate la velocità delle forche replicative e la dimensione dei repliconi, in popolazioni cellulari di controllo ed in seguito al trattamento con afidicolina (APH), un inibitore della DNA polimerasi, valutando diverse dosi e diverse tempistiche. Anzitutto l’analisi è stata affrontata a livello dell’intero genoma, e quindi dei loci di mio interesse. Dopo aver verificato che il trattamento con APH non arresta la progressione del ciclo cellulare, se non dopo 24 ore di trattamento con la dose più elevata, le analisi ad alta risoluzione hanno mostrato che, dopo due ore di trattamento, vi è un forte decremento della velocità di progressione delle forche replicative ed una conseguente diminuzione delle dimensioni dei repliconi.. Alla luce di questi dati ho quindi valutato la dinamica di replicazione all’interno delle diverse regioni di interesse, e in parallelo al molecular combing ho utilizzato anche tecniche di citogenetica molecolare classiche, quali la FISH su nuclei in interfase. Quest’ultima è stata importante per comprendere meglio quali siano le regioni a replicazione tardiva, e come atteso è emerso che i due siti fragili replicano più tardivamente delle regioni di controllo. Dall’analisi dei nuclei in interfase è emerso anche che il trattamento con afidicolina provoca un generale rallentamento della progressione della replicazione in tutti i loci considerati, tenuto conto delle differenti modalità di ciascuna regione. Per quanto riguarda lo studio condotto tramite l’utilizzo del molecular combing, queste analisi si sono concentrate sulla regione di FRA6E-PARK2 e del locus di controllo HPRT. I dati ottenuti mostrano una forte riduzione della velocità delle forche replicative, in accordo con i dati ottenuti a livello dell’intero genoma, e un aumento della frequenza delle forche unidirezionali in entrambe le regioni. Tuttavia, la risposta del sito fragile allo stress replicativo si manifesta soprattutto come un blocco molto evidente delle origini replicative, mentre nella regione di HPRT si assiste ad una aumentata attivazione di origini, come dimostrato dal fatto che la distanza stimata tra origini è significativamente inferiore a quella osservata nei linfociti di controllo. Nel corso del progetto ho valutato la possibilità di poter studiare la replicazione delle regioni di mio interesse in popolazioni cellulari arricchite per la fase S del ciclo cellulare: a questo scopo ho effettuato degli esperimenti di separazione delle cellule per centrifugazione elutriale. In questo modo si evita l’utilizzo di sostanze chimiche, che possono interferire con l’espressione delle regioni fragili. Questi esperimenti sono stati condotti utilizzando linee cellulari linfoblastoidi, perché era già stato verificato che il metodo non è utilizzabile con linfociti primari. L’isolamento di sottopopolazioni arricchite in fase S è stato possibile e consentirà di sviluppare ulteriormente le analisi sulle fasi tardive della replicazione del DNA, allo scopo di meglio comprendere la modalità con cui i siti fragili si replicano e rispondono allo stress replicativo.