Production and characterization of SulP anion transporters

The main subject of this thesis is the Sulphate Permease (SulP) protein family that includes more than two hundred members, identified in archaea, bacteria, fungi, plants and animals. Many of these proteins have been functionally characterized: most are anion exchangers or transporters with different substrate specificities and distinct mechanism of action (Saier et al., 1999). In mammals, the SulP family, known as Solute Linked Carrier 26 (SLC26), is composed of eleven members with important roles in normal physiology (Mount and Romero, 2004). The SulP proteins show a similar structural organization: a hydrophobic central core, which includes ten or twelve membrane helixes, and a less conserved C-terminal cytoplasmic portion that includes a STAS domain (Sulphate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist domain). Despite the functional role of the STAS domain is still unclear, it appears to be crucial for the regulation of the transport activity (Ko et al., 2004; Zheng et al., 2005; Shibagaki and Grossman, 2006). Its fundamental role is also underlined by the fact that mutations that alter this domain in the SLC26 family can cause loss of function, resulting in serious genetic diseases, like diastrophic dysplasia or Pendred syndrome (Dawson and Markovich, 2005). No three-dimensional structure of STAS domains or full-length sequences is available for any SulP anion transporter. One part of the work was focused on the production of different forms of the STAS domain from different species, for the biophysical and structural characterization. Another part of the SulP project was performed at the Johann Wolfgang Goethe University of Frankfurt (Germany) and aimed at the production of some full-length SulP proteins, by a cell-free expression system, an emerging technique for the large-scale production of membrane proteins. In the last year, I was also involved in the crystallographic study of the Green Fluorescence Protein mutant, GFPmut2, in collaboration with Prof. Stefano Bettati of the University of Parma (Italy). The main aim of this work was the elucidation of the structural basis of the spectroscopic properties of this mutant, in particular with respect to changes in pH. The GFP chromophore can, in fact, exist either in a protonated or deprotonated state, with distinct spectral properties (Tsien, 1998). In a previous spectroscopic characterization, GFPmut2 (Ser65Ala, Val68Leu, Ser72Ala) was found more sensitive than the wild type GFP to pH changes in the physiological range (Chirico et al., 2002). The structures of GFPmut2 at pH 6 and pH 9 were determined at around 1.6 Å resolution, allowing the correlation between the spectral and structural properties.

L’oggetto principale di questo lavoro di tesi è la famiglia dei trasportatori anionici SulP (Sulphate Permease), che comprende più di duecento membri identificati in archea, batteri, funghi, piante e animali. Molte proteine di questa famiglia sono state funzionalmente caratterizzate e agiscono da trasportatori o scambiatori di anioni, e differiscono per l’affinità verso il substrato e il meccanismo di trasporto (Saier et al., 1999). Nei mammiferi la famiglia SulP, conosciuta come "Solute Linked Carrier 26" (SLC26), è composta di undici membri che svolgono un ruolo fondamentale in molti processi fisiologici nell’uomo (Mount e Romero, 2004). Tutte le proteine SulP possiedono un’organizzazione strutturale simile: una parte centrale idrofobica, che comprende dieci o dodici eliche di membrana e una porzione C-terminale citoplasmatica meno conservata, che include il dominio STAS (Sulphate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist). Sebbene non sia ancora chiaro il ruolo funzionale di questo dominio nei trasportatori di anioni, esso sembra essere di cruciale importanza per la regolazione dell’attività di trasporto (Ko et al., 2004; Zheng et al., 2005; Shibagaki e Grossman, 2006). Il suo ruolo fondamentale è rilevato anche dal fatto che mutazioni che alterano questo dominio nei membri della famiglia SLC26 possono comprometterne seriamente la funzionalità, causando malattie genetiche gravi, come la displasia diastrofica o la sindrome di Pendred (Dawson and Markovich, 2005). Non sono ancora note strutture tridimensionali di nessun dominio o intera proteina SulP. Una parte del lavoro è stata focalizzata sulla produzione di diverse varianti del dominio STAS da specie diverse, finalizzata alla caratterizzazione biofisica e strutturale. Una seconda parte del progetto, svolta presso la "Johann Wolfgang Goethe University" di Francoforte (Germania), ha riguardato la produzione di intere proteine SulP mediante la sintesi in vitro, una tecnica molto promettente per la produzione su larga scala di proteine di membrana. Durante l’ultimo anno, mi sono anche dedicata allo studio cristallografico di un mutante della Green Fluorescent Protein, GFPmut2, in collaborazione con il gruppo del Prof. Stefano Bettati dell’Università di Parma. L’obiettivo principale di questo lavoro è stato definire le basi strutturali delle proprietà spettroscopiche di questo mutante, in particolare al variare del pH. Il cromoforo della GFP può, infatti, esistere sia in forma protonata che deprotonata (Tsien, 1998). Le proprietà spettroscopiche della GFPmut2 (Ser65Ala, Val68Leu, Ser72Ala) sono state in precedenza caratterizzate e, rispetto alla proteina wild type, sembra essere più sensibile alle variazioni di pH nell’intervallo fisiologico (Chirico et al., 2002). A tal fine, è stata determinata la struttura della GFPmut2, sia a pH 6 che a pH 9, con una risoluzione di circa 1.6 Å. Il confronto delle due strutture ha consentito la correlazione delle proprietà strutturali con quelle spettroscopiche.