Dynamic Covalent Capture per lo studio di interazioni non covalenti

This thesis describes the development of a methodology for the detection and the quantification of weak noncovalent interactions. The field of application of this methodology ranges from bioorganic chemistry,1 to material science2 and nanotechnology.3 The interest in developing new methodology rises from the difficulty to obtain experimental data on the quantification of the energetic contributions of weak interactions to the formation of noncovalent complexes. This project was inspired by the “Double Mutant Cycle” (DMC) methodology proposed by Hunter and coworkers for the quantification of noncovalent interactions in synthetic systems.4 DMC relies on the installment of a thermodynamic cycle, based on the consecutive mutation of the residues involved in the interaction. The thermodynamic stability of the mutant complexes is then correlated to the energetic contribution of thenoncovalent interaction. The new approach extends on this methodology and addsDynamic Covalent Capture (DCC) to it as a novel feature .5,6 DCC describes the concomitant presence of a weak noncovalent interaction and a dynamic covalent bond in the same molecule. Because the noncovalent interaction occurs intramolecularly, the system is highly sensitivity to the nature and strength of these interactions. The presence of the dynamic covalent bond serves to perform thermodynamic equilibrium studies. This is highly attractive from a a practical point of view, since it allows self-selection processes between opposite recognition units. A DMC cycle is installed by comparing the equilibrium constants of two equilibrium reactions. The first equilibrium is between the target system and a single mutant lacking one of the interacting components. The second equilibrium is between a mutant lacking the other recognition unit and the double mutant, lacking both. 1H NMR experiments provide the value of ΔG° for every equilibrium: their difference provides the ΔΔG value of the strength of the noncovalent interaction in a straightforward manner. In the first chapter this methodology has been applied to quantify the strength of an electrostatic interaction between a phosphonate and ammonium group joined in the same molecule through a reversible hydrazone bond. A remarkable result of a systematic study on a series of imines and hydrazones was the observation that the thermodynamic stability of the system not only results from the (expected) electrostatic interaction, but also from the occurrence of a hydrogen bond between the phosphonate group and the hydrazone linker. In the second part of the work, the approach was extended to a larger library, in order to fully exploit the opportunities of the system, in particular the ability to extract information from a dynamic system composed of multiple equilibria. These studies were aimed at quantifying the the effect of neighboring spectator groups on the strength of the intramolecular interaction.7 A dynamic library was composed by mixing 4 scaffold molecules with various degree of substitution on the aromatic ring, 2 hydrazides and 2 amines. The aldehyde of each scaffold was isotopically labeled, to enable the analysis of the complex mixture via 13C NMR spectroscopy. The major advantage of using 13C NMR over 1H NMR consists in the possibility to quantify a much larger library with with a single NMR experiment. This analysis provided the relative thermodynamic stabilities of 16 compounds (8 hydrazones + 8 imines), which could be compared to determine the quantify the effect of neighboring spectator groups. In the last part, the obtained results on the strength of the intramolecular stabilization of the phosphonate group were correlated to catalysis. In accordance with previous studies, the phosphonate group was taken as a transition state analogue (TSA) of a transesterification reaction.8 The aim of this project was to establish whether a quantitative correlation existed between the strength of the intramolecular interaction between phosphonate and neighboring groups observed in the previous chapters and rate acceleration of the hydrolysis of the corresponding phenyl esters due to transition state stabilization The introduction in the structure of groups able to increase the stability of a set of hydrazones/imine, is expected to enhance the reactivity of the corresponding esters, with the formation of an intramolecular recognition with transition state. This enhancement was indeed observed, but only in case the transition state represented by the TSA was corresponded to the Rate Determining Step (RDS) of the reaction. In those conditions, we found a good correlation between eactivity and thermodynamic stability of the corresponding TSA, even quantitatively when the exchange experiments and kinetic experiments were performed under identical experimental conditions. This shows that DCC can be conveniently used to obtain information on the stabilization of a reaction transition state, which makes it a powerful tool for catalyst development.

Lo scopo di questo progetto di Tesi consiste nello sviluppo di una metodologia in grado di individuare e quantificare interazioni non covalenti in soluzione. Una metodologia in grado di fornire informazioni riguardo alla natura e all’intensità di interazioni non covalenti trova applicazioni in molti ambiti, dalla chimica bioorganica, alla scienza dei materiali alle nanotecnologie. L’interesse in questo tipo di studi nasce dalla difficoltà di ottenere sperimentalmente questo tipo di informazioni, indirizzando la ricerca verso lo sviluppo di approcci innovativi in grado di fornire risultati in modo semplice e immediato. Il lavoro presentato ha tratto ispirazioni dalla metodologia denominata Double Mutant Cycle (DMC) proposta da Hunter e collaboratori, per lo studio delle interazioni non covalenti in sistemi sintetici. Questo approccio propone la costruzione di un ciclo termodinamico basato sulla mutazione consecutiva dei residui coinvolti nell’interazione, correlando la loro stabilità termodinamica alla formazione di un’interazione non covalente. In pratica il ciclo elimina i contributi dovuti agli effetti secondari indotti dalla mutazione, permettendo di determinare in modo accurato l’interazione tra i residui in esame. L’approccio presentato in questa Tesi prevede un’implementazione di questa metodologia, introducendo l’utilizzo del Dynamic Covalent Capture (DCC) per la misura della stabilità termodinamica relativa di due specie. , L’incremento di sensibilità si rileva a seguito della formazione di un legame covalente tra le due molecole interagenti, in modo tale che il riconoscimento avvenga in maniera intramolecolare. Dal punto di vista pratico, il DCC si basa sull’esistenza di un equilibrio di scambio, la cui posizione è determinata dalla presenza o meno di un’interazione tra le molecole coinvolte. Il DMC è costruito sulla base di due equilibri di scambio: nel primo le molecole si mostrano in grado di dare riconoscimento molecolare, mentre il secondo è utilizzato come riferimento. Per ognuno dei due equilibri viene valutata la costante termodinamica ΔG° relativa allo scambio, analizzando la composizione della miscela tramite 1H NMR: la differenza tra le due costanti termodinamiche così ottenute ΔΔG fornisce l’intensità dell’interazione non covalente che determina lo shift del primo equilibrio rispetto al secondo. Questa metodologia ha permesso di riconoscere e quantificare interazioni non covalenti di diversa natura all’interno dei sistemi in esame, sia di origine elettrostatica, sia di tipo legame idrogeno. E’ stato eseguito uno studio sistematico dell’interazione all’interno di una serie di idrazoni e immine, valutando gli effetti della natura e della flessibilità dello spacer. Nella seconda parte del lavoro lo studio viene esteso a una libreria di composti più ampia, con lo scopo di individuare l’effetto di gruppi spettatori nell’evento di riconoscimento. A questo scopo è stata considerata una libreria formata da 4 scaffold variamente sostituiti all’anello, una coppia di idrazoni e una di ammine. Gli scaffold presentano sulla posizione aldeidica un carbonio isotopicamente marcato per permettere lo studio della composizione della libreria tramite spettroscopia 13C NMR. Il vantaggio introdotto dall’utilizzo della tecnica 13C NMR rispetto al 1H NMR precedentemente utilizzato consiste nella possibilità di determinare la concentrazione di una libreria di composti molto più vasta, composta da idrazoni e immine, attraverso un singolo esperimento NMR. In questo modo gli esperimenti di equilibrazione si svolgono mescolando contemporaneamente tutti gli scaffold e una coppia di idrazidi o ammine in un unico tubo. In questo modo si ottiene la stabilità relativa di tutte le specie che viene correlata con l’intensità dell’interazione non covalente in esse presente. In questo modo è stato ottenuto uno schema di stabilità relativa di tutti i 16 composti (8 idrazoni + 8 immine) che formano il sistema. L’ultima parte dell’elaborato presenta l’applicazione della metodologia basata sul DCC allo studio dell’interazione non covalente all’interno dello stato di transizione di una reazione modello. Studi precedenti hanno mostrato come le molecole utilizzate durante gli studi di scambio possano essere utilizzate come analoghi dello stato di transizione (TSA) della reazione di transesterificazione di un estere: in questo modo la stabilità dei composti precedentemente studiati può essere correlata numericamente con la reattività dei relativi esteri fenilici rispetto alla transesterificazione con sodio metossido in metanolo. Come l’introduzione del gruppo ammonio in catena laterale dell’idrazone/immina induce una stabilizzazione termodinamica a seguito del riconoscimento intramolecolare, così lo stesso gruppo dovrebbe determinare una maggiore reattività della specie in cui esso è presente. Gli studi evidenziano che una correlazione è evidenziabile solo nel caso in cui lo stato di transizione mimato dal TSA (l’attacco nucleofilo) costituisca anche il Rate Determinig Step (RDS) della reazione. Utilizzando un regime sperimentale in cui questo è verificato, si dimostra una buona correlazione qualitativa tra la reattività e la stabilità termodinamica del corrispondente TSA. Infine nel caso in cui gli esperimenti cinetici e quelli di stabilità possano essere svolti nello stesso regime sperimentale, si ottiene un’ottima correlazione numerica tra la reattività dei composti in esame e la stabilità termodinamica dei corrispondenti TSA. Questi risultati evidenziano come il DCC fornisca una metodologia unica e semplice per ottenere informazioni riguardo allo stato di transizione di una reazione, permettendo l’accesso a dati sperimentali che sarebbero difficilmente ottenibili con altre tecniche.