Structural studies of the ribosome: rRNA building blocks characterization and interactions analysis

The first high resolution crystal structures initiated a new era in ribosomal studies in which investigations depend on knowledge of atomic coordinates. The studies I conducted on the three-dimensional structure of the ribosome aim to reveal and understand the ribosome modular organization, and at the same time to investigate protein-RNA interaction mechasisms. All the results presented in this thesis refer to the case study of the large ribosomal subunit 50S of Haloarcula marismortui, omitting the 5S rRNA. Three-dimensional RNA motifs are the basic building blocks of ribosomal RNA (rRNA) architecture. A novel method to search for these substructures, based on shape histograms, is presented in Chapter 2. The shape histogram is a vector representation of the distribution of distances between a set of points and a fixed one. Shape histograms are not only an efficient tool to compare RNA fragments, but also they well capture the structural similarities behind the flexible and highly variable structure of ribosomal RNA. The method outperforms existing ones in time efficiency, reaching the same level of correctness. Branching points of three or more helices, named junctions, are the most variable and complex loops of rRNA, and the least characterized. Shape histograms together with angles between inter-helical fragments provide major informations on the 3D conformation of junctions: angles give informations on the eccentricity of the loop, while shape histogram range and distribution reveal the folding. Based on these features I propose a possible classification of these motifs with respect to their 3D conformation. Finally in Chapter 4 I dissect protein-RNA interactions within the ribosome. Statistical analysis reveal distinguishing features of the ribosome with respect to protein interactions with other RNA molecules, such as the dominant role of the ribose group. Furthermore protein interaction mechanisms with known RNA motifs are investigated, in particular with standard tetraloops, kink-turns, and single extruded nucleotides in general. A consensus interaction pattern is detected for protein contact surfaces with standard tetraloops, characterized by dense areas of contacts made by positive residues (mainly arginine). Ribosomal proteins also reveal a characteristic binding site with kink-turns in correspondence of the extruded base. Due to its shape, this site has been called tripod. Tripods proved to be common to several single extruded nucleotides. Besides a conserved shape, tripods show a preference towards purines, especially adenine, and typically make hydrogen bonds.

Le prime strutture cristallizate ad alta risoluzione diedero inizio ad una nuova era negli studi sui ribosomi, era nella quale la ricerca beneficia delle coordinate spaziali di ogni singolo atomo. Gli studi che ho condotto sulla struttura tridimensionale del ribosoma puntano a compredere l’organizzazione modulare della molecola, ed allo stesso tempo ad investigare i meccanismi di interazione proteine-RNA. Tutti i risultati presentati in questa tesi riferiscono alla subunità principale 50S di Haloarcula marismortui, omettendo il filamento di RNA 5S. Motivi tridimensionali ricorrenti sono i mattoni basilari dell’architettura dello RNA ribosomiale: essi sono caratterizzati da una struttura 3D conservata, e ricorrono frequentemente all’interno della molecola. Un nuovo metodo per ricercare queste sotto strutture, basato su shape histogram, è presentato al Capitolo 2. Lo shape histogram è una rappresentazione vettoriale della distribuzione delle distanze di un insieme di punti da uno fissato. Gli shape histogram non sono solo strumenti efficienti per confrontare frammenti diversi di RNA, sono inoltre in grado di catturare le similarità strutturali nascoste dalla struttura flessibile ed altamente variabile dello RNA ribosomiale. Il metodo infatti si dimostra più efficiente di quelli noti in letteratura, ed ugualmente efficace in termini di correttezza dei risultati. Tra i loop studiati, le giunzioni di tre o più eliche sono il tipo più variabile e complesso, ed il meno caratterizzato. Gli shape histogram insieme alle sequenze di angoli formati dai frammenti congiungenti più eliche sono in grado di dare molte informazioni sulla conformazione tridimensionale di queste giunzioni: gli angoli forniscono indicazioni sull’eccentricità di una giunzione, mentre range e distribuzione dei valori degli shape histogram rivelano il folding. Basandosi su queste caratteristiche, propongo una classificazione per questi motivi rispetto alla loro conformazione nello spazio. Infine il Capitolo 4 esamina le interazioni proteine-RNA all’interno del ribosoma. Osservazioni di tipo statistico rivelano caratteristiche distintive del ribosoma rispetto alle interazioni proteiche con altri tipi di RNA, come ad esempio il ruolo dominante del gruppo ribosio. Inoltre vengono studiati i meccanismi di interazione delle proteine con i motivi strutturali, in particolare standard tetraloop, kink-turn e basi esposte. Un pattern comune di interazioni è rintracciato per le superfici di contatto formate dalle proteine con i tetraloop, caratterizzato da zone dense di interazioni fatte da aminoacidi a carica positiva (principalmente arginine). Le proteine ribosomiali rivelano inoltre un sito di contatto caratteristico nelle interazioni con i kink-turn, in corrispondenza della base esposta. Per la sua forma questo sito è stato chiamato tripod, ovvero tripode. I tripodi si sono dimostrati essere in realtà comuni a molti nucleotidi non accoppiati la cui base è esposta. Oltre ad una conformazione tridimensionale conservata, i tripodi dimostrano una preferenza verso le purine, soprattutto adenina, e tipicamente formano legami idrogeno.