Complesso macromolecolare responsabile dell'endocitosi dell'albumina: un ruolo a livello glomerulare? Studio di espressione genica di CLCN5 e megalina in biopsie microdissezionate di nefropatie proteinuriche

ClC-5 and Megalin are part of the same macromolecular complex involved in the re-uptake of albumin in the proximal tubuli. To understand the relationship between this mechanism and proteinuric kidney diseases, we have performed gene expression study of CLCN5 and Megalin genes in glomerular (gl) and tubular interstitial (ti) compartments of patients with type 2 diabetes (NIDDM) and IgA nephropathy (IgAN). Gene expression of CLCN5 and Megalin was investigated by Real-Time PCR in microdissected biopsies (mpb) (under a stereomicroscope) from patients with IgAN (n 10) and with NIDDM (n 9). Both groups had similar level of proteinuria. As controls, we used cortical tissues obtained from sites remote from tumor bearing renal tissue (n 9). Moreover, we analyzed human mesangial cells (HMC), endothelial cells (HuVEC), tubular cells (HK-2) and podocytes (HP) in basal conditions. HMC and HK-2 were also examined in high glucose and albumin conditions respectively. We found that: 1) CLCN5 and Megalin were expressed in all mbp both at gl and ti levels, and their expression did not differ between gl and ti of NIDDM and IgAN; 2) CLCN5 and Megalin expression levels were significantly higher in proteinuric nephropathies than in controls both at gl and ti compartment. In order to exclude ti contamination in microdissected glomeruli, we performed gene expression analysis of CLCN5 and Megalin also on laser microdissected glomeruli from 28 NIDDM patients and 14 controls that confirmed our previous results. In these mbp a direct correlation between CLCN5 and Megalin was evidenced (r=0,50 p=0,0039); 3) CLCN5 transcript was evidenced in all cells analyzed, on the contrary, very low levels of Megalin were detected; 4) HK-2 treated with albumin showed the same level of CLCN5 expression as untreated cells; 5) HMC treated with high glucose for 24 and 48 hours showed the same level of CLCN5 expression as untreated cells. Our study reveals, for the first time, that CLCN5 and Megalin genes are expressed in human glomeruli, and that all the cell types constituting the glomerulus express in vitro CLCN5. The overexpression of CLCN5 and Megalin in diabetic and IgA nephropathy biopsies suggests that proteinuria might regulate their expression. The in vitro experiments on HMC exclude the role of glucose in the up-regulation of ClC-5 expression in diabetic glomerulopathy. A role might be hypothesized for podocytes since podocyte endocytosis of proteins does occur in proteinuric patients.

ClC-5 e Megalina sono due delle proteine che compongono il complesso macromolecolare coinvolto nel riassorbimento dell’albumina a livello del tubulo prossimale. Per comprendere meglio se ci fosse una relazione tra questo meccanismo e le patologie proteinuriche abbiamo effettuato uno studio di espressione per i geni CLCN5 e Megalina nei compartimenti glomerulare e tubulo interstiziale di pazienti con diabete di tipo II (NIDDM) e nefropatia a depositi di IgA (IgAN). L’espressione di CLCN5 e Megalina è stata investigata mediante Real-Time PCR in biopsie microdissezionate manualmente grazie all’ausilio di uno stereomicroscopio. Queste sono stete ottenute da pazienti con diabete di tipo II (n°9) e nefropatia a depositi di IgA (n°9). Come controllo è stato utilizzato tessuto corticale ottenuto da polo renale indenne in corso di nefrectomia per tumore. Entrambi i gruppi di pazienti analizzati presentavano livelli simili di proteinuria. Abbiamo inoltre analizzato cellule mesangiali umane (HMC), cellule endoteliali umane (HuVEC) cellule tubulari umane (HK-2) e podociti umani (HP) in condizioni basali. HMC e HK-2 sono state anche analizzate rispettivamente in presenza di alte concentrazioni di glucosio e a diverse concentrazioni di albumina. Abbiamo trovato che: 1) CLCN5 e Megalina sono entrambi espressi in tutte le biopsie microdissezionate sia a livello glomerulare che a livello tubulo interstiziale e i loro livelli di espressione erano simili nei due compartimenti in entrambe le patologie; 2) i livelli di espressione sono risultati maggiori nelle nefropatie proteinuriche rispetto ai controlli sia a livello tubulo interstiziale che a livello glomerulare. Per escludere un’eventuale contaminazione del compartimento glomerulare da parte del tubulo prossimale abbiamo chiesto la collaborazione del Dott. J.J.Baelde del Leiden University Medical Center che ha effettuato l’analisi di espressione di CLCN5 e Megalina su glomeruli microdissezionati mediante laser ottenuti da biopsie di pazienti NIDDM (n°28) e su glomeruli sani di controllo (n°14), confermando i nostri precedenti risultati. In queste biopsie microdissezionate è inoltre emersa una correlazione diretta tra CLCN5 e Megalina (r=0,5, p=0,0039); 3) la presenza di CLCN5 è stata evidenziata e quantificata in tutte le cellule analizzate, mentre per Megalina sono stati rilevati livelli molto bassi di espressione; 4) le cellule HK-2 stimolate con albumina hanno mostrato gli stessi livelli di espressione di CLCN5 delle cellule non trattate; 5) le cellule HMC stimolate con glucosio hanno mostrato gli stessi livelli di espressione di CLCN5 delle cellule non trattate. Il nostro studio evidenzia per la prima volta la presenza di CLCN5 e Megalina a livello del compartimento glomerulare nell’uomo ed inoltre che tutti i tipi cellulari costituenti il glomerulo esprimono in vitro CLCN5. La sovrespressione di CLCN5 e Megalina nelle biopsie dei pazienti diabetici e con nefropatia da IgA suggerisce un loro ruolo nella fisiopatologia della proteinuria e la loro correlazione diretta, emersa tra l’espressione genica delle due proteine nel glomerulo, fa ipotizzare un loro meccanismo d’azione coordinato simile a quello presente nel tubulo prossimale. Gli esperimenti in vitro sulle HMC escludono un ruolo del glucosio nella modulazione dell’espressione di CLCN5 nella patologia diabetica. Un ruolo in questo processo potrebbe essere ipotizzato per i podociti in quanto i risultati da noi ottenuti bene si affiancano ai dati in letteratura che mostrano che i podociti, nei pazienti proteinurici, sono in grado di endocitare proteine.