Caratterizzazione della regione carbossi-terminale della proteina strutturale GAG del virus dell'immunodeficienza felina (FIV)

Feline Immunodeficiency Virus (FIV), a non-primate lentivirus, causes an immunodeficiency syndrome in domestic cats, that is striking similar to AIDS in humans. FIV is similar to HIV-1 in many molecular and biochemical properties, thus representing an attractive model for AIDS research in many different aspects ranging from pathogenesis to therapeutic approaches. In addition, based on these similarities and exploiting its peculiar features, FIV could be the basis for the development of a safe gene delivery system to target specific cells in different human organs and tissues. In order to fully take advantages of these important properties and considering that the present understanding of FIV biology lags behind knowledge accumulated on HIV, different aspects of FIV life cycle need to be further investigated. RNA-enveloped viruses bud from infected cells by exploiting the Multivesicular Body (MVB) pathway. In this context, ubiquitination of structural viral proteins and their direct interaction with cellular factors involved in the MVB biogenesis through short proline rich regions, named Late domains (L domains), are crucial mechanisms. As for all the other retroviruses, FIV Gag can assemble and lead to Virus Like Particles (VLPs) budding from cells in the absence of any other viral factors. The overall goal of the project is to optimize FIV structural proteins production with the aim to improve VLPs release. In particular, we focused our attention on the production and maturation of viral particles and specifically, on the role of the major structural FIV Gag protein in viral budding. Moreover, we investigated the interaction between Gag and the cellular proteins belonging to the MVBs to understand how FIV exploits this cellular pathway for its budding. Here we report that, in contrast with HIV-1, FIV is strictly dependent for its budding on a PSAP-type L domain, mapping in the carboxy-terminal region of Gag, irrespective of a functional viral protease. Moreover, a LLDL motif was identified in the p2 Gag C-terminal region. We were able to show that the budding of a FIV mutant construct containing the completely knocked down L domain was rescued by the overexpression of AIP1 and that this cellular protein is incorporated in FIV VLPs. In the present study we demonstrate that FIV, thanks to its L domain function, hijacks the MVB biogenesis machinery to execute its efficient exit from cells. Indeed, the MVB pathway block by the overexpression of a dominant negative mutant of the cellular AAA-ATPase Vps4, which is essential for the MVB formation, induces a significant reduction of released VLPs, also in the absence of viral protease. Moreover, this result was supported by Tsg101 incorporation in VLPs and by the demonstration of CHMP3 involvement in FIV release. We provide evidence that FIV budding is related to Gag ubiquitination that is linked to the presence of an active L domain. Moreover, although FIV Gag does not contain a PPxY motif, we show that the Nedd4-2s ubiquitin ligase enhances FIV Gag ubiquitination and it is capable to rescue viral mutants characterized by a completely knocked down L domain or by the lack of the p2 Gag region. Nedd4-2s may cooperate with other L domains to enhance viral budding, maybe leading to the ubiquitination and consequent activation of MVB components, as we demonstrate here it occurs for Tsg101. In contrast with HIV-1, we show that Nedd4-2s ubiquitin ligase is not incorporated in FIV viral particles. In conclusion our data bring to light peculiar aspects of FIV Gag carboxy-terminal region and in particular those related to viral budding, that may have an impact when FIV is employed as a model for studying HIV pathogenesis and therapy, or for its biotechnological applications. We also demonstrate that a non-primate lentivirus shares with HIV-1 a novel mechanism of connection to the cellular budding machinery.

Lo studio dei determinanti virali e cellulari che regolano il rilascio delle particelle retrovirali dalle cellule infettate riveste un ruolo cruciale sia nello studio della biologia di base del virus, allo scopo di identificare nuovi target terapeutici, sia nello sviluppo di vettori per il trasferimento di proteine/geni a scopo vaccinale/terapeutico. In tale contesto, la poliproteina Gag, espressa in assenza di ogni altra proteina virale, è in grado di produrre particelle simil virali (VLP). I virus ad RNA dotati di envelope gemmano dalle cellule infettate sfruttando il pathway del Multivesicular Body (MVB). In questo ambito, fondamentali sono l'ubiquitinazione delle proteine strutturali virali e la loro diretta interazione con fattori cellulari coinvolti nella biogenesi dei MVB attraverso corti motivi aminoacidici ricchi in prolina, noti come domini di assemblaggio tardivo (Late assembly domain o L domain). Il presente lavoro di dottorato si inserisce in un progetto di ricerca più ampio che si propone di ottimizzare la produzione delle proteine strutturali del Virus dell'Immunodeficienza Felina (FIV), al fine di migliorare l'ottenimento di VLP. In particolare, ci si è proposti di valutare aspetti quali produzione e maturazione delle particelle simil virali e di studiare le interazioni della proteina Gag con proteine cellulari che cooperano con la funzione dei motivi tardivi in essa contenuti. A tale scopo, è stata ottenuta una serie di costrutti FIV-derivati, esprimenti la proteina Gag mutagenizzata nella regione carbossi-terminale a livello dell'L domain, che com'è noto svolge un ruolo essenziale nelle fasi tardive della replicazione virale. In questo modo è stato possibile dimostrare come FIV, a differenza del Virus dell'Immunodeficienza Umana (HIV), è strettamente dipendente per la sua gemmazione dal dominio L PSAP, indipendentemente dalla funzionalità della proteasi virale. E' stato inoltre identificato un secondo putativo L domain con funzione ausiliaria, motivo LLDL, localizzato all'interno della regione p2 di Gag situato a valle rispetto al primo. E' stato possibile dimostrare come i suddetti domini L permettano a FIV di sfruttare il pathway cellulare di biogenesi dei MVB per gemmare in modo efficiente dalle cellule e di come tale fenomeno sia correlato ad una significativa ubiquitinazione di Gag, possibile solamente in presenza di un L domain attivo. In particolare è stato osservato come il blocco del pathway dei MVB, mediante la sovraespressione di un mutante dominante negativo della proteina cellulare Vps4, essenziale per la formazione dei MVB, porti ad una riduzione significativa nel rilascio di VLP anche in assenza di proteasi attiva. Inoltre, questo risultato è supportato dalla dimostrazione dell'incorporazione di Tsg101 nelle particelle virali e del coinvolgimento di CHMP3 nella gemmazione virale. Infine, sono state fornite interessanti evidenze che, sebbene FIV non possieda un dominio PPxY, l'ubiquitino ligasi Nedd4-2s aumenta il livello di ubiquitinazione della proteina Gag. Probabilmente, Nedd4-2s può cooperare con altri L domain per aumentare il rilascio virale o forse può portare all'ubiquitinazione e conseguente attivazione di componenti del MVB come dimostrato in questo studio avviene per Tsg101. Inoltre, questa particolare ubiquitino ligasi è in grado, senza venire incorporata nelle particelle virali, di ripristinare un efficiente rilascio di un mutante di FIV privo di un attivo L domain. In conclusione i dati ottenuti hanno permesso di chiarire alcune caratteristiche peculiari della regione carbossi-terminale della proteina Gag di FIV e più in particolare della fase di rilascio delle particelle virali. E' stato dimostrato come un lentivirus dei non primati condivida con HIV-1 un nuovo meccanismo di collegamento al macchinario cellulare di gemmazione.