The blood-brain barrier and San Filippo Syndrome: a model for pathophisiology studies of CNS in lysosomal storage diseases

The lysosomal storage diseases (LSDs) are a large and heterogeneous group of disorders resulting from defects in various aspects of lysosomal function. They commonly afflict infants and young children and mostly involve pathology of the brain which is currently untreatable when it’s present. All animals with a well developed central nervous system (CNS) have a blood-brain barrier (BBB) that largely isolates the brain from alterations in the composition of the blood stream and the continuous changes that take place in these general body fluids. This BBB also impedes the global CNS delivery of many therapeutic materials. Some studies in mouse models of lysosomal storage diseases, such as Batten and Sandhoff diseases and GM1 gangliosidosis, have also suggested that the BBB may be damaged as an integral part of the disease process. The aim of the present project was to determine whether similar changes to the BBB occur in Sanfilippo Syndrome. The in situ brain perfusion technique is the elective system for this study as it is not necessary to consider the effects of plasma binding, metabolism and other interactions within the body. Furthermore, it offers a superior sensitivity over other tracer based methods and can be used to precisely quantify the transport of solutes across the BBB. We developed a novel modification of the original technique of Takasato and Smith (1984) which ensures that all regions of the mouse brain are perfused rather than just the territory of a single carotid artery. This is important as in LSDs all brain regions are affected and in different mouse strains the circulus arteriosus cerebri exhibits different degrees of completeness (Ward et al. 1990). Thus the method allows full regional BBB function to be assessed, and the method can be applied to a comparison of genetically modified animals on differing genetic backgrounds. Several parameters, such as cerebral perfusion flow, brain vascular volume, and carrier-mediated transport of excitatory amino acids glutamic acid and glycine, were then investigated to determine whether the in situ brain perfusion method may be applied to the mouse without disturbance to the physical or functional integrity of the BBB. Electron microscopy studies with lanthanum nitrate were also performed to assess whether the tight junctions became leaky during the course of perfusion. Once the in situ brain perfusion technique was established as a real tool for assessing the penetrance of tracers across the BBB, this method was applied to determine if there were changes to the BBB in mouse models of two of the Sanfilippo Syndrome diseases (MPS IIIA and MPS IIIB) compared with their respective control strains of mouse. [14C]-sucrose and [3H]-inulin were used to assess vascular volume, but do not normally penetrate the BBB, unless it is defective. [14C]-diazepam was used as a marker of cerebral blood flow; and [3H]-glycine, [3H]-glutamic acid and [3H]-tyrosine as carrier-mediated substances with low brain penetrance. These are neuro-excitatory amino acids which can cause brain damage if their entry into brain is increased. Initial findings in Sanfilippo syndrome from in situ brain perfusion technique, though they need to be confirmed and examined more fully, showed the typical clinical heterogeneity of Sanfilippo patients and clearly highlight that some changes occurred in the BBB. Also the BBB permeability of [3H]- N-butyl-deoxynojirimycin (NB-DNJ, miglustat, Zavesca®) was assessed as it is currently employed for substrate-reduction therapy (SRT), is believed to penetrate the BBB and theoretically could be used to treat secondary storage in Sanfilippo Syndrome. From intraperitoneal injections of [3H]- NB-DNJ and evaluation of the unidirectional influx constant Kin for time intervals up to 60 minutes, a slow but progressive brain uptake of this small molecule was demonstrated. An improved understanding of the BBB and its function, both in health and disease, is absolutely and critically necessary for development of successful new and improved drugs that may repair the BBB and in addition are also capable of crossing the normal BBB in order to further treat early CNS manifestations of Sanfilippo Syndrome. These studies will produce information which will aid drug targeting in general to the CNS and will further advance the possibility of treating a wide range of neurodegenerative diseases.

Le patologie d’accumulo lisosomiale (LSD) rappresentano un grosso ed eterogeneo gruppo di malattie genetiche che derivano da difetti in diversi aspetti della biologia lisosomiale. Queste patologie interessano più comunemente i bambini, e per la maggior parte determinano coinvolgimento neurologico che, quando presente, non è trattabile. Tutti gli animali con un sistema nervoso centrale (SNC) ben sviluppato hanno una barriera emato-encefalica (BEE) che isola ampiamente il cervello dalle alterazioni nella composizione del flusso del sangue e dai continui cambiamenti che avvengono in generale in questi fluidi corporei. Questa barriera impedisce anche la somministrazione globale al SNC di molte sostanze terapeutiche. Diversi studi condotti in modelli murini delle malattie d’accumulo lisosomiale, come le patologie di Batten, Sandhoff e GM1 gangliosidosi, hanno inoltre suggerito che la BEE possa essere danneggiata come parte integrante del processo patologico. Lo scopo del presente progetto è stato quello di determinare se avvenissero simili cambiamenti nella BEE nella sindrome di Sanfilippo. La tecnica della perfusione cerebrale in situ è il sistema di elezione per questo studio in quanto per le molecole analizzate non è necessario considerare gli effetti dovuti ad eventuali legami con le proteine plasmatiche, metabolismo e altre interazioni all’interno del corpo. Inoltre, offre una sensibilità superiore rispetto ad altri metodi basati su tracciante e può essere usata per quantificare precisamente il trasporto di soluti attraverso la BEE. Abbiamo apportato una nuova modifica alla tecnica originale di Takasato e Smith (1984) che assicura che tutte le regioni del cervello del topo siano perfuse piuttosto che solo la zona di una singola carotide. Questo è importante poiché nelle LSD tutte le regioni cerebrali sono coinvolte e il circulus arteriosus cerebri presenta differenti gradi di completezza in diversi ceppi murini (Ward et al. 1990). Quindi il metodo permette che la funzione della BEE sia valutata in tutte le regioni, e può essere applicato per comparare animali modificati geneticamente di diversi background genetici. Diversi parametri, come il flusso della perfusione cerebrale, il volume vascolare del cervello, e il trasporto carrier-mediato degli amminoacidi acido glutammico e glicina, sono stati investigati per determinare se il metodo della perfusione cerebrale in situ possa essere applicato al topo senza disturbare l’integrità fisica e funzionale della BEE. Sono stati anche condotti studi con nitrato di lantano, e analizzati al microscopio elettronico, per valutare se le giunzioni occludenti subissero aperture durante il corso della perfusione. Una volta che la tecnica della perfusione cerebrale in situ è stata provata come strumento reale per la valutazione della penetrazione di traccianti attraverso la BEE, questo metodo è stato applicato per determinare se ci fossero cambiamenti nella BEE in modelli murini di due forme della sindrome di Sanfilippo (MPS IIIA e MPS IIIB) in confronto ai loro rispettivi ceppi murini di controllo. [14C]-saccarosio e [3H]-inulina sono stati impiegati per valutare il volume vascolare, ma normalmente non penetrano la membrana, a meno che non sia difettiva. [14C]-diazepam è stato utilizzato come marker del flusso sanguigno cerebrale; e [3H]-glicina, [3H]-acido glutammico e [3H]-tirosina come sostanze carrier-mediate a bassa penetrazione cerebrale. Questi sono amminoacidi neuro-eccitatori che possono causare danni al cervello se la loro entrata nel cervello è aumentata. Dati iniziali per la sindrome di Sanfilippo dalla tecnica della perfusione cerebrale in situ, sebbene necessitino di essere confermati e approfonditi, hanno dimostrato la tipica eterogeneità clinica dei pazienti di Sanfilippo ed evidenziano chiaramente che avvengono alcuni cambiamenti nella BEE. Anche la permeabilità di [3H]-N-butil-deossinojirimicina (NB-DNJ, miglustat, Zavesca®) alla BEE è stato valutata poichè è attualmente impiegata nella terapia di riduzione del substrato (SRT), si ritiene che penetri la BEE e teoricamente potrebbe essere usata per trattare l’accumulo secondario nella sindrome di Sanfilippo. Da iniezioni intraperitoneali di [3H]- NB-DNJ e valutazione della costante d’influsso unidirezionale Kin per intervalli di tempo fino a 60 minuti, un lento ma progressivo assorbimento di questa piccola molecola è stato dimostrato. Una comprensione maggiore della BEE e della sua funzione, sia in salute sia in malattia, è assolutamente e criticamente necessaria per lo sviluppo di farmaci nuovi e migliori che possano riparare la BEE e in più siano anche in grado di attraversare la BEE allo scopo di trattare manifestazioni precoci della sindrome di Sanfilippo nel SNC. Questi studi produrranno informazioni che aiuteranno la somministrazione di farmaci al SNC in generale e aumenteranno ulteriormente la possibilità di trattare un ampio numero di patologie neurodegenerative.