Cyclical neurogenesis and neurodegeneration in the colonial tunicate Botryllus schlosseri

In this work, we studied the nervous and sensory system of the colonial ascidian Botryllus schlosseri during the development of embryos, buds, and in adult individuals belonging to young and old colonies. B. schlosseri is a colonial ascidian in which individuals (blastozooids) are organized in star-shaped systems. In a colony, sexual and asexual reproductions are coordinated and cyclical. Moreover, three generations of zooids coexist: adults (filter-feeding individuals), their buds (primary buds), and the budlets (secondary buds) produced by buds. Cyclically, during a phase called takeover, adult zooids are reabsorbed by the colony and are replaced in physiological activities by their buds that become adults. Cuncurrently, budlets mature into buds and produce a new generation of budlets. We first reviewed historical studies concerning B. schlosseri with the intent of characterizing the colony life cycle and bud development. We then compared nervous system formation in two different developmental pathways, embryogenesis and blastogenesis. Since B. schlosseri has internal fertilization and development, we developed a method for culturing embryos in vitro. Using a combination of in vivo, confocal, histological observations, and 3D reconstructions based on serial sections, we described the embryonic development and drafted a timetable. Next, we sequenced transcriptomes of embryos and buds at several stages and illuminated the strict temporal relationship between morphogenetic events and the expression pattern of genes associated with the nervous system during the formation of the larval brain, its degeneration at metamorphosis, the adult brain formation in embryo and bud, and its degeneration at takeover. We also studied the nervous system in adult individuals belonging to colonies of different ages. We observed that the number of brain cells changes throughout the adult zooid life following a specific trend. Transmission electron microscopy and TUNEL assays on adult brains showed that apoptosis is involved in neurodegeneration and the number of immunocytes contacting or infiltrating the brain increase in number during the adult life. Changes in brain cell number parallel changes in sensory cell number. We developed two novel behavioural experiments for B. schlosseri, which showed that zooid ability to respond to mechanical stimuli parallels changes in the number of brain and sensory cells. Then we compared adult individuals belonging to young and old colonies and found that aging influences both nervous system morphology and behaviour. We analysed differentially expressed genes in brains of individuals belonging to young and old colonies and found that the old colonies exhibit a gene pattern associated with several human neurodegenerative diseases, such as the Alzheimer’s disease. Finally, we studied, the coronal organ, a mechanoreceptor located on the tentacles, in the oral siphon. We analysed its cytodifferentiation during asexual reproduction and we documented the mechanosensorial impairment caused by gentamicin at morphological and behavioural level. In mammals gentamicin can destroy both hair cells and their innervating neurons. The pre-treatment with fenofibrate, a gentamicin protector, followed by a treatment with gentamicin, resulted in no significant effect on animal behaviour. These results support the hypothesis of homology between vertebrate hair cells and tunicate coronal sensory cells. In conclusion, the research presented here shows that B. schlosseri can be considered a useful model species for analysing the development of the central nervous system and sensory system, as well as its degeneration as caused by drugs, metamorphosis, takeover and aging. Additionally, the species’ different developmental pathways allow for interesting evolutionary comparisons, at both the morphological and molecular level, that can help improve scientific understanding of the origin of the animal phenotype.

Nel presente lavoro, ho studiato il sistema nervoso e sensoriale dell'ascidia coloniale Botryllus schlosseri durante lo sviluppo dell’embrione, delle gemme e degli individui adulti appartenenti a colonie giovani e meno giovani. In B. schlosseri, gli individui (blastozooidi) sono organizzati in sistemi a forma di stella. La colonia è composta, oltre che da zooidi adulti, da gemme e gemmine che si sviluppano tramite riproduzione asessuata, o blastogenesi, rispettivamente dagli zooidi adulti e dalle gemme. Ciclicamente, durante una fase chiamata takeover (rappresentante il momento di cambio di generazione), gli zooidi adulti vengono progressivamente riassorbiti dalla colonia e sostituiti nelle loro attività fisiologiche dalle loro gemme che diventano quindi i nuovi adulti della colonia. Inoltre, durante questa fase di cambio generazionale, le gemmine maturano in gemme producendo a loro volta una nuova generazione di gemmine. Nella vita di una colonia, riproduzione sessuata e asessuata sono coordinate e cicliche. Inizialmente, ho rivisto gli studi storici riguardanti B. schlosseri con lo scopo di caratterizzare il ciclo di vita della colonia e lo sviluppo delle gemme. Ho poi confrontato la formazione del sistema nervoso nei due diversi percorsi di sviluppo che caratterizzano B. schlosseri: l'embriogenesi e la blastogenesi. Poiché la fecondazione e lo sviluppo embrionale in questa specie avvengono all’interno del corpo del genitore, ho sviluppato un metodo per coltivare gli embrioni in vitro. Integrando le osservazioni in vivo, al microscopio confocale, l’istologia e ricostruzioni 3D basate su sezioni seriali, ho descritto lo sviluppo embrionale nel tempo. Successivamente, grazie al sequenziamento di embrioni e gemme nelle diverse fasi di sviluppo, ho studiato la stretta relazione temporale presente tra gli eventi morfogenetici e il pattern di espressione dei geni associati al sistema nervoso durante la formazione del cervello nell’embrione, la sua degenerazione alla metamorfosi, la formazione del cervello adulto nella gemma, e la sua degenerazione durante il takeover. Inoltre, ho studiato il sistema nervoso durante la vita degli individui adulti e appartenenti a colonie di diversa età. A riguardo, ho osservato che il numero di cellule cerebrali cambia durante tutta la vita dello zooide adulto seguendo uno specifico trend. La microscopia elettronica a trasmissione e le analisi TUNEL sui cervelli adulti hanno dimostrato che l'apoptosi è coinvolta nella neurodegenerazione e il numero di immunociti che contattano o si infiltrano nel cervello aumentano di numero durante la vita adulta. Questi cambiamenti nel numero di cellule cerebrali sono accompagnati anche da simili variazioni nel numero di cellule sensoriali. Inoltre, ho sviluppato due nuovi esperimenti comportamentali dimostrando che la capacità degli zooidi di rispondere a stimoli meccanici è in stretta relazione con il numero di cellule cerebrali e sensoriali. In seguito, ho confrontato la morfologia del sistema nervoso ed eseguito esperimenti comportamentali in individui adulti appartenenti sia a colonie giovani sia a quelle meno giovani, rilevando che l'invecchiamento influenza entrambi questi aspetti. Infine, ho analizzato i geni differentemente espressi nei cervelli di individui appartenenti a colonie giovani e vecchie scoprendo che le vecchie colonie mostrano un modello genetico associato a diverse malattie neurodegenerative umane, come il morbo di Alzheimer. Infine, ho studiato l'organo coronale, un meccanorecettore situato sui tentacoli del sifone orale, ritenuto omologo alle cellule capellute dei vertebrati. Ho analizzato il suo citodifferenziamento durante la riproduzione asessuata e documentato il deterioramento meccanosensoriale a livello morfologico e comportamentale causato dalla gentamicina. Nei mammiferi, la gentamicina può distruggere sia le cellule capellute che i neuroni sensoriali associati. Il pre-trattamento con fenofibrato, una sostanza che protegge rispetto all’azione della gentamicina, seguito da un trattamento con gentamicina, non produceva alcun effetto significativo sul comportamento animale. Questi risultati supportano l'ipotesi dell'omologia tra cellule capellute dei vertebrati e cellule sensoriali coronali tunicate. In conclusione, la ricerca qui presentata mostra che B. schlosseri può essere considerato una specie modello utile per analizzare lo sviluppo del sistema nervoso centrale e del sistema sensoriale, così come la sua degenerazione causata da farmaci, metamorfosi, takeover e invecchiamento. Inoltre, i diversi percorsi di sviluppo della specie consentono interessanti confronti evolutivi, sia a livello morfologico che molecolare, che possono aiutare a comprendere l'origine del fenotipo animale.