The odorant receptor expressed at the axon terminal of olfactory sensory neurons: mechanism of activation and function

A unique feature in the topographic organization of the olfactory bulb (OB) is the dual role of the odorant receptor (OR). It detects odors but it also plays an instructive role in the convergence of olfactory sensory neuron axons expressing the same odorant receptor to form glomeruli in specific loci of each olfactory bulb. This segregation of sensory afferents gives rise to the olfactory map, that has a critical role in encoding odors. How the OR could accomplish such different roles has remained enigmatic for more than 20 years. If the OR can determine axon convergence, it should act as an axon guidance molecule. The demonstration that the OR is expressed not only at the cilia, but also at the axon terminal, a suitable location for an axon guidance molecule, corroborated this hypothesis. However the mechanism of activation and the function of the OR at the axon terminal has remained unknown for all these years. The odorant receptors (OR) expressed at the cilia, is a G-protein-coupled receptor, that upon binding odorant molecules, activates a specific G-protein, Golf, that stimulates adenylyl cyclase type III (ACIII) to produce cyclic AMP (cAMP). cAMP, in turn, opens olfactory specific nucleotide-gated (CNG) channels, driving an influx of Ca2+ and Na+ within the cell. The rise of intracellular calcium concentration opens Ca2+ activated Cl channels, leading to a Cl- efflux, that further depolarizes the membrane potential. More recently, Lodovichi's group demonstrated for the first time that the odorant receptor expressed at the axon terminus-growth cone of the olfactory sensory neurons is functional and coupled to local increase of cAMP and Ca2+. These second messengers play a key role in axon elongation and turning in several systems, including the olfactory system, where it has been shown that the OR-derived cAMP contributes to the location of the glomeruli in the olfactory bulb. The open critical question that remained to be addressed was the mechanism of activation and function of the odorant receptor at the axon terminal. In particular, what are natural ligands of the odorant receptor expressed at the axon terminal? A few molecules expressed in the olfactory bulb could bind and activate the odorant receptors expressed at the axon terminal. To verify this hypothesis, Lodovichi's group purified several groups of molecules (by chromatographic procedures) from the embryonic rat olfactory bulb and tested their ability to activate the OR at the axon terminal. Performing real time Ca2+ imaging in olfactory sensory neurons, they observed that a pool of molecules from the olfactory bulb, locally applied, was able to elicit a prompt Ca2+ rise at the axon terminal. By mass spectrometry of the active pool of molecules, phosphatidylethanolamine-binding protein-1 (PEBP1), also known as Raf kinase inhibitory protein (RKIP), was identified as a putative ligand of the axonal OR. PEBP1 is a ~21 KDa protein that belongs to a highly conserved family of proteins, expressed in numerous tissues and cell types in a variety of species. In rodents, PEBP1 is expressed in several brain areas, both in neurons and in non-neuronal cells. The physiological function of PEBP1 in the brain has remained obscure. Its low molecular weight, its ability to be secreted, to modulate G-protein coupled receptor (GPCR) and the presence of olfactory deficits in mice carrying a null mutation for PEBP1 (PEBP1-/- mice), make PEBP1 a putative OR ligand. During my PhD work, I have studied whether PEBP1 could activate the OR and its contribution in the formation of the sensory map. First, we studied Ca2+ dynamics in response to PEBP1, in rat and mouse olfactory sensory neurons (OSN) loaded with the calcium indicator, fura-2, and transfected with a specific odorant receptors (OREG, P2, ORS6, Olfr62 and M72) We found that rat embryonic olfactory sensory neurons exhibited a prompt Ca2+ rise in response to PEBP1 locally applied at the axon terminal with a glass pipette. Noteworthy, PEBP1 extracted from rat bulb elicited a prompt Ca2+ rise also at axon terminus of mouse olfactory sensory neurons, suggesting that this response is highly conserved between species. To ascertain that the Ca2+ rise in response to PEBP1 observed in OSN was due to OR receptor activation, we performed Ca2+ imaging in Human embryonic kidney 293 cells (HEK293Tcells) transfected with specific odorant receptors (OREG, P2, S6, Olfr62, M72), loaded with the calcium indicator fura-2 and challenged with PEBP1 and with the specific odor ligand (used as control). HEK293Tcells transfected with a specific odorant receptor exhibited a prompt Ca2+ rise in response to PEBP1 and to the cognate odor for the specific odor receptor HEK293Tcells transfected with the odorant receptor M72 did not exhibit Ca2+rise in response to PEBP1 but only to the M72 cognate-odor ligand methylsalicylate. This result indicates that there are likely a few other ligands that can activate the OR. Indeed, HEK293Tcells transfected only with the empty-vector (pCI, not expressing any odorant receptors) did not exhibit Ca2+rise in response to PEBP1, nor to the cognate odor ligand. These data demonstrated that PEBP1 elicits Ca2+response via odorant receptor activation. HEK293T cells loaded with fura-2 and transfected with specific OR, did not present a Ca2+ response when challenged with PEBP1 denatured by higher temperature or with proteinase K. To exclude that possible contaminants in the purification procedure, could trigger Ca2+ responses, HEK cells expressing specific OR and loaded with fura-2, were challenged with a cyclin-dependent kinase 2 (CDK2), a protein isolated with the same purification procedure of PEBP1. No calcium rise was observed in response to CDK-2, confirming the specificity of PEBP1 response. Axon guidance molecules steer the direction of axon elongation. To explore whether that was the case for PEBP1, we performed time-lapse imaging of single olfactory sensory neuron axon behaviour in response to a gradient of molecules able to modulate cAMP and Ca2+ signaling at the axon terminal (i.e forskolin). We found that PEBP1 regulates the turning behaviour of sensory axons with a similar effect of forskolin (FRSK) or odors able to modulate the level of cAMP and Ca2+ at the growth-cone of OSN. The turning behaviour of OSN was not affected by Ringer’ solution, used as a negative control. Where is PEBP1 expressed in the olfactory bulb? By immunofluorescence on embryonic, postnatal rat and mouse olfactory bulb (OB) sections, we found that PEBP1 is expressed in periglomerular cells, a suitable location to act on incoming axons. PEBP1 is expressed with a patchy pattern mostly in the anterior (A), medial (M) and lateral (L) side of the bulb while in the posterior (P) side is hardly detected. By immunofluorescence, RT-PCR and western blot we observed that PEBP1 was not expressed in olfactory sensory neurons (OSNs) located in the main olfactory epithelium (MOE) of embryonic, postnatal rats. Accordingly, no staining for PEBP1 was observed in the core of the glomeruli. For all these techniques, we used as a negative control tissues from mice carrying a null mutant of PEBP1 (PEBP1-/- mice). If PEBP1 plays an important role in the 1). organization and 2). location of glomeruli in the OB, then PEBP1 mutant mice (PEBP1-/- mice), should exhibit a disrupted sensory map. To verify this hypothesis PEBP1 mutant mice (PEBP1-/- mice), were crossed with mice in which specific OR is co-expressed with GFP (such P2-GFP , M72–YFP mice) and we analyze the convergence of GFP positive fibers to form glomeruli in the bulb. We found that in PEBP1 -/-mice the convergence of sensory neurons expressing P2-OR were disrupted by the presence of several additional heterogeneous glomeruli while sensory neurons expressing M72 (not responsive to PEBP1 in vitro) were not affected. Noteworthy, the alteration in the topographic organization of the sensory map in PEBP1 -/- mice crossed with P2-GFP mice was stronger in homozygous than in heterozygous mice, showing a dosage dependent effect. We then evaluated the location of specific glomeruli in the OB, a crucial aspect of the topographic map. We computed the position of the main P2 and M72-homogeneous glomeruli (i.e. formed exclusively by sensory axons expressing the same OR) in whole-mount bulbs along the antero-posterior (A-P) and dorso-ventral axis (D-V). We found that the position of the P2-glomeruli was significantly shifted along the antero-posterior axis (A-P) in PEBP1 mutant mice compared to controls. The defect was stronger in homozygous than in heterozygous PEBP1-/- mice crossed with P2-GFP mice, showing a dosage dependent effect. No defects were reported along the D-V axis, in agreement with the presence of specific molecules that dictate the location of glomeruli along the D-V axis. The location of M72-glomeruli was similar in control and PEBP1-/-, in agreement with the unaltered organization of the M72 glomeruli and with our in vitro data, in which the odorant receptor P2, but no M72, was responsive to PEBP1. To explore the functional outcome of the altered sensory map, we analyzed the olfactory behaviour in PEBP1-/- mice. We performed an olfactory habituation-dishabituation test that showed an olfactory deficit in the detection and discrimination of a new odor in PEBP1-/- mice compared to control mice. The data obtained in my PhD thesis suggested that the OR at the axon terminal can act as an axon guidance molecule activated by the natural ligand identified, PEBP1.

Una caratteristica peculiare dell'organizzazione topografica del bulbo olfattivo (OB) è il "duplice ruolo" dei recettori olfattivi (OR). Esso, infatti, non è unicamente coinvolto nella percezione degli odori, ma svolge anche un ruolo cruciale nella convergenza assonale di neuroni sensoriali olfattivi (OSN) esprimenti lo stesso OR, nella formazione di glomeruli in specifiche regioni del OB. Tale organizzazione delle afferenze sensoriali dà origine alla mappa sensoriale. Ciò nonostante, il meccanismo attraverso cui l'OR svolga queste due distinte funzioni è rimasto sconosciuto per più di 20 anni. Se l'OR svolgesse uan funzione nella convergenza assonale, potrebbe agire come "axon guidance", molecole guida, per gli assoni stessi. A sostegno di questa ipotesi, è stato dimostrato che l'OR è espresso non solo alle cilia del neurone sensoriale olfattivo, ma anche nell'assone terminale, assumendo quindi una posizione ottimale per guidarne il movimento. Il loro meccanismo di attivazione, così come la loro funzione all'assone terminale, rimane però sconosciuta. I recettori olfattivi (OR) espressi nelle ciglia, sono recettori accoppiati a proteine G che, in seguito al legame con molecole odorose, attivano una specifica proteina G, Golf, che stimola l'adenilato ciclasi di tipo III (ACIII) a produrre AMP ciclico (cAMP). Quest'ultimo induce l'apertura di specifici canali regolati da nucleotidi ciclici chiamati "cyclic nucleotide-gated (CNG)", con conseguente influsso di ioni Ca2+e Na+ nel citoplasma della cellula. Tale aumento intracellulare di Ca2+ attiva canali di Cl- che, permettendo l'uscita di ioni Cl- dal citoplasma, depolarizzando la cellula. Recentemente, il gruppo della Dott.ssa Lodovichi ha dimostrato per la prima volta che il recettore olfattivo espresso all'assone terminale (cono di crescita) dei OSN è funzionale e accoppiato ad un locale incremento di cAMP e Ca2+. Ca2+ e cAMP sono due secondi messaggeri che svolgono un ruolo chiave nell'allungamento e nel "turning" movimento assonale in diversi sistemi, compreso il sistema olfattivo, in cui è stato dimostrato che cAMP che si produce in seguito all'attivazione del recettore olfattivo contribuisca a formare i glomeruli in una specifica posizione nell' OB. Il punto critico che rimane da affrontare e definire è il meccanismo di attivazione e la funzione del recettore olfattivo espresso all'assone terminale dei OSN. In particolare: Quali siano i ligandi naturali espressi all'assone terminale? Un gruppo ristretto di molecole espresse nel bulbo potrebbero legare e attivare il recettore olfattivo espresso all'assone terminale. Al fine di verificare questa ipotesi il gruppo della Dottoressa Lodovichi è stato in grado di identificare un gruppo di molecole (mediante tecniche cromatografiche) estratte da bulbi olfatti di ratti embrionali e ne ha testato la capacità di attivare l'OR all'assone terminale. Attraverso la tecnica dell'imaging del calcio in neuroni sensoriali olfattivi, il gruppo della Dott.ssa Lodovichi ha osservato che un gruppo di molecole applicate localmente, è in grado di attivare i neuroni sensoriali olfattivi, determinando una risposta di calcio all'assone terminale. Mediante spettrometria di massa delle molecole in grado di attivare l'OR è stato identificato un possibile ligando dell'OR espresso all'assone terminale dei OSN. Si tratta di una proteina, apparentemente alla famiglia delle etanolammine, chiamato phosphatidylethanolamine-binding protein-1 (PEBP1) o inibitore delle Raf chinasi (RKIP). PEBP1 è una proteina di circa ~21 KDa che appartiene ad una famiglia di proteine molto conservata espressa in diversi tessuti di diverse specie. Nei roditori PEBP1 è espressa in diverse aree cerebrali, sia in neuroni che in cellule non neuronali. La funzione fisiologica di PEBP1 nel cervello rimane tuttavia non nota . Il suo basso peso molecolare, il fatto che venga secreta, che moduli i recettori accoppiati a proteine G, nonchè la presenza di deficit olfattivi in linee di topo che possiedono mutazioni di PEBP1 (topi PEBP1 -/-), rendono PEBP1 un possibile ligando del recettore olfattivo. Durante il mio lavoro di tesi di dottorato ho investigato se e in che modo PEBP1 potesse attivare l'OR e il suo contributo nella formazione della mappa sensoriale olfattiva. Come primo step, sono state studiate le dinamiche del calcio in risposta a PEBP1 sia nei neuroni sensoriali di ratto che di topo, caricati con l'indicatore di calcio, fura-2. Questi esperimenti hanno permesso di identificare risposte calcio in seguito all'applicazione di PEBP1 all'assone terminale di OSN di ratto embrionale mediante una pipetta di vetro. Degno di nota è che PEBP1, estratto dal bulbo olfattivo di ratto è in grado di indurre risposte calcio anche in OSN di topo. Questa evidenza suggerisce che l'aumento di calcio in risposta all'applicazione di PEBP1 è altamente conservata tra le specie. Al fine di verificare che l'aumento di calcio in risposta di PEBP1 osservato in OSN fosse dovuto all'attivazione di OR, esperimenti di calcium imaging sono stati effettuati in linee cellulari derivate da cellule endoteliari di rene embrionale umano (HEK293T). Alle linee cellulari HEK, trasfettate con uno specifico OR (OREG, P2, S6, Olfr62, M72) caricate con l'indicatore per il calcio fura-2, è stato applicato PEBP1 e il corrispondente odore del OR trasfettato. Nelle linee cellulari HEK293T trasfettate con specifici OR (OREG, P2, S6, Olfr62) è stata osservata un'immediata risposta di calcio intracellulare in seguito sia all'applicazione di PEBP1 che dell'odore specifico del OR trasfettato usato come controllo); Un' eccezione è stata riscontrata in HEK293T esprimenti il recettore M72 che sono responsive soltanto per l'odore specifico di M72 (Methylsalicilate) ma non a PEBP1. Questo risultato suggerisce la presenza di altre molecole, oltre che a PEBP1, che possano attivare l'OR. Inoltre, in HEK293T trasfettate con il solo vettore pCI, non esprimente l' OR, non è stato osservato alcun aumento di calcio intracellulare nè in risposta a PEBP1, nè all'odore specifico del OR trasfettato, ma solamente in risposta al carbacolo, usato come test di vitalità cellulare. Questi risultati mettono in evidenza che l'aumento di calcio intracellulare in seguito all'applicazione di PEBP1 è dovuto all'attivazione del OR. Tuttavia, PEBP1 denaturato mediante alte temperature o con proteinase K non determina alcuna risposta di calcio intracellulare in HEK293T trasfettate con OR specifico. Al fine di escludere che la presenza di contaminanti nella procedura di purificazione, possa indurre una risposta calcio nelle linee cellulari HEK esprimenti uno specifico OR è stato applicata un'altra proteina chinasi 2 ciclina-dipendente (CDK2), purificata con lo stesso protocollo di PEBP1. Nessuna risposta di calcio intracellulare è stata osservata confermando la specificità di risposta di PEBP1. Molecole guida "axon guidance" dirigono l'allungamento assonale. Al fine di investigare se PEBP1 fosse in grado di modulare il movimento assonale, è stato valutato il comportamento del cono di crescita mediante la tecnica di " time-lapse imaging"sul singolo assone in risposata a gradienti di molecole in grado di modulare il signaling dei secondi messaggeri cAMP e Ca2+ all'assone terminale (es. foscolina). Abbiamo osservato che PEBP1 regola il movimento dell'assone di OSN con un simile effetto della foscolina o degli odori, capaci di modulare i livelli di cAMP e Ca2+ al cono di crescita del neurone sensoriale olfattivo. Dov'è espresso PEBP1 nel bulbo olfattivo? Mediante la tecnica di immunofluorescenza su sezioni di OB di ratto embrionale, postanatale e di topo, è stata osservata l'espressione di PEBP1 nelle cellule periglomerulari, un' ottima posizione per guidare gli assoni degli OSN. PEBP1 è espresso con un pattern discontinuo, maggiormente nella regione anteriore (A), mediale (M) e laterale (L) dell'OB mentre è difficile osservare cellule positive per PEBP1 nella zona posteriore (P). Mediante immunofluorescenza, RT-PCR e western blot è stato osservata l'assenza di espressione di PEBP1 nei OSN localizzati nell'epitelio olfattivo (MOE) di ratti embrionali, postnatali e di topo. In accordo con queste evidenze, PEBP1 non è espresso nel "cuore" dei glomeruli. Per tutte queste tecniche, tessuti provenienti da una linea di topo con mutazioni per PEBP1 (topi PEBP1-/-) sono stati utilizzati come controlli negativi. Se PEBP1 giocasse un ruolo importante nell' organizzazione e nella posizione dei glomeruli nel bulbo olfattivo (OB), linee di topi che presentano mutazioni per questa proteina (topi PEBP1-/-), dovrebbero mostrare alterazioni nella mappa sensoriale. Al fine di verificare questa ipotesi, i topi che presentano mutazioni per PEBP1 (topi PEBP1-/-) sono stati incrociati per linee di topi in cui uno specifico OR è co-espresso con una proteina fluorescente, GFP (es. come le linee di topi P2-GFP , M72–YFP). In queste linee di topi è stata studiata la convergenza delle fibre positive per la proteina fluorescente (GFP) nella formazione dei glomeruli nell'OB. La convergenza assonale dei OSN esprimenti il recettore P2-OR è distrutta dalla presenza di numerosi glomeruli eterogenei, mentre quella delle fibre esprimenti il recettore M72 (non responsivo a PEBP1 in vitro) non è alterata. Degno di nota è che l'alterazione nell'organizzazione topografica della mappa sensoriale è maggiormente evidente nei topi omozigoti per la mutazione di PEBP1 rispetto ai topi eterozigoti, suggerendo un meccanismo dosaggio dipendente. Successivamente, è stata valutata la posizione di specifici glomeruli nel OB, un punto cruciale della mappa topografica. Nessun difetto è stato riportato lungo l'asse dorso-ventrale (D-V) del bulbo, in accordo con la presenza di altre molecole che guidano le afferenze assonali dei OSN nella formazione dei glomeruli in una specifica posizione lungo l'asse dorso-ventrale del OB. La posizione del glomerulo M72 non differisce tra i topi PEBP1-/- e controlli. Questo dato è in accordo con una normale organizzazione dei glomeruli in cui convergono le fibre-M72 e con i dati in vitro in cui il recettore P2 ma non M72 è responsivo per PEBP1. Al fine di investigare l'effetto funzionale dell'alterazione della mappa sensoriale è stato effettuato un test olfattivo (habituation-dishabituation test) nei topi PEBP1-/-. E' stato riscontrato un deficit olfattivo nel riconoscimento e discriminazione degli odori nei topi PEBP1-/- rispetto ai controlli. Tutti i dati raccolti in questa tesi di Dottorato suggeriscono che OR espressso all'assone terminale può agire come molecola guida attivate dal ligando naturale del OR identificato PEBP1.