"Retinal Disorders: advanced methods for the genetic diagnosis and genotype-phenotype correlations"

Abstract Background: According to the World Health Organization, 39 million people is completely blind. Between the genetic disorders causing visual impairment, by affecting 1 person to 3000-4000, Inherited Retinal Dystrophies, Occult Macular Dystrophy and Age-related Macular Degeneration are the most diffuse. Inherited Retinal Disorders (IRD) are retinal degenerations caused by mutations in at least 280 genes and more loci. IRD can be both syndromic or not-syndromic, inherited or sporadic, and all the inheritance patterns are possible. In fact, in addition to the autosomal dominant, autosomal recessive and the X-linked forms, sporadic, digenic and mitochondrial ones are possible. One of the most significant characteristics is their great genetic heterogeneity, due to the high number of genes and possible mutations involved. These genes transduce proteins involved in phototransduction and visual cycle processes, expressed in retinal pigmented epithelium or photoreceptors cells. The diseases are progressive and characterized by difficulties in night vision, loss of peripheral vision and photophobia, until complete blindness. Besides the genetic heterogeneity, these pathologies are characterized by allelic and clinical heterogeneity, which make the clinical diagnosis and the genotype-phenotype correlations complex, whenever the genetic cause is known. If genetic heterogeneity is determined by the presence of different mutations that induce the same clinical manifestation, clinical (or allelic) heterogeneity occurs in the presence of mutations on the same gene that cause different phenotypes. While Occult Macular Dystrophy (OMD) is an inherited macular dystrophy caused by mutation in RP1L1 gene with an autosomal dominant pattern of inheritance, Age-related Macular Degeneration (AMD) is a complex disorder caused by an association of genetic, environmental and advanced age susceptibility. Currently no diagnostic tests or definitive treatment for these disorders are available. Aim of the study: The objective of this project is the development of diagnostic tests valid for the genetic characterization of patients affected by IRD or OMD. For this purpose, 620 patients and affected family members were clinically characterized, and a genetic biobank was created from the collection of their DNA, available for possible genetic testing. Based on the pathology they are affected, diagnostic tests were performed using Sanger sequencing or Next Generation Sequencing (NGS), following which correlations between the genotype and the phenotype were made. Materials and methods: IRD patients were recruited and DNA extracted from blood samples. Retinal tissue and biopsies were collected too, in accordance with the current legal regulations. Genetic screening of 190 patients was realized using NGS targeted technology by MiSeq Illumina and identified mutations were then confirmed using Sanger sequencing. Genotype-phenotype correlations were elaborated, and risk factors determination was performed in 118 patients by means TaqMan PCR for 7 polymorphisms. OMD patients were screened for RP1L1 gene and 60 proband suspected to be affected by X-linked retinitis pigmentosa for RP2 and RPGR genes using Sanger sequencing. After a clinical anamnesis and in-depth visual examination, the patients were subjected to blood sampling from which the DNA was extracted and stored in the biobank. In parallel, a retinal biobank was generated from the collection of donors' retinas, collected according to the regulations in force. Genetic screening was performed on 190 patients affected by different autosomal recessive or dominant forms of IRD, using the targeted NGS technology, with panels of 25 genes. After selecting the variants or mutations identified by the analysis, Sanger sequencing was performed to confirm them. The correct attribution of the results to the analyzed individuals was achieved by comparing the genetic profiles obtained from the biobank DNA and the residual one from the NGS analysis. Genetic screening of patients with X-linked forms of IRD (n = 60) or OMD (n = 5) was obtained by means of Sanger sequencing of RPGR and RP2 (IRD) or RP1L1 (OMD) genes. A genetic susceptibility tool was developed and applied to 118 patients (39 of whom previously screened with NGS), using real time PCR, to evaluate the expression of 7 polymorphisms associated with AMD in subjects affected by IRD. Results: With NGS screening 256 variants/mutations were identified in 126 patients. Among these, 49% is represented by novel alterations. The most mutated genes are USH2A (15%) and ABCA4 (14%), while no alteration was found in the BEST1, CRX, LRAT and RLBP1 genes. 27% of cases were completely resolved, while 39% only partially, due to the identification of only one recessive mutation or of variants of uncertain significance. Missense variants cover 80% of the total, followed by nonsense mutations (9%), frameshift insertions/deletions (8%), in-frame insertions/deletions (2%) and splicing alterations (1%). The correlation of the identified genotype with the diagnosed phenotype was possible in about half of genetically characterized patients. From the comparison it was possible to identify triallelic forms, often with the missense G1961E mutation of ABCA4 as an aggravating allele, and a new gene-disease association for the PRPF31 gene that in three patients causes Usher's syndrome. The analysis of the probands with X-linked forms of Retinitis Pigmentosa allowed the identification of a frameshift insertion in the ORF15 of the RPGR gene, a nonsense mutation in RPGR gene and an already known missense mutation in RP2, in three distinct families. Among the patients with OMD, the missense S1199F mutation in RP1L1 was identified for two of them. The susceptibility test for the 7 SNPs showed a high genetic high of AMD in 38 subjects, medium high in 16, medium in 36, and low in 28. Conclusions: NGS technology has proved to be a useful diagnostic tool for the autosomal dominant or autosomal recessive forms of retinal dystrophies, allowing massive and parallel sequencing of many genes and patients. The percentage of genetically characterized patients is consistent with the data in the literature. The use of a panel of genes turns out to be an acceptable compromise between the results obtained and the criticality related to the large amount of output data, compared to whole genome or whole exome sequencing. Much of the genetic data has been correlated with the clinical manifestations of the patients. Sanger technology, gold standard of sequencing, is optimal for the identification of the genetic cause in all pathologies where one or a few genes are involved, such as the X-linked forms of IRD or the OMD. The expression of risk factors, predisposing to macular degeneration, while not correlating with the severity of the confirmed mutations, could provide important relationships with the pathologies of which the subjects are affected. The identification of the genetic causes of these pathologies will bring a new thrust to the development of gene and cell therapies, fundamental for the treatment of hereditary retinal diseases.

Riassunto Presupposti dello studio: Secondo l’organizzazione mondiale della sanità, 39 milioni di persone sono ciechi. Tra principali cause genetiche che inducono compromissione visiva, con una prevalenza di 1:2500-4000, le Distrofie Retiniche Ereditarie (i.e. Inherited Retinal Dystrophy - IRD), la Distrofia Maculare Occulta (OMD) e la Degenerazione Maculare legate all’Età (AMD) sono le più diffuse. Le prime sono un gruppo di patologie che inducono degenerazioni retiniche indotte da mutazione in almeno 280 geni e molti loci. Le forme di IRD possono essere sindromiche o non sindromiche, sporadiche o ereditarie, con tutti i pattern di eredità possibili. Infatti, oltre alle forme autosomiche dominati e recessive e le forme legate al cromosoma X, sono possibili forme sporadiche, digeniche e mitocondriali. Una delle principali caratteristiche di queste patologie è la loro elevata eterogeneità, legata all’elevato numero di geni e di mutazioni coinvolti. Questi geni, infatti, codificano proteine coinvolte nei processi di foto-trasduzione e del ciclo visivo, espressi principalmente nelle cellule dell’epitelio pigmentato retinico o nei fotorecettori. Queste malattie hanno un andamento progressivo che inizia, generalmente, con difficoltà nella visione notturna, perdita della visione periferica e fotofobia, fino alla cecità assoluta. Oltre alla eterogeneità genetica, queste patologie sono caratterizzate da eterogeneità allelica e clinica, che rendono complessa la diagnosi clinica ed anche le correlazioni genotipo-fenotipo, qualora si conosca la causa genetica del paziente. Se l‘eterogeneità genetica è determinata dalla presenza di differenti mutazioni che inducono la stessa manifestazione clinica, l’eterogeneità clinica (o allelica) si ha in presenza di mutazioni sullo stesso gene che causano fenotipi differenti. Mentre la Degenerazione Maculare Occulta è una distrofia maculare ereditaria causata da mutazioni nel gene RP1L1, con una trasmissione autosomica dominate, la Degenerazione Maculare legata all’Età è una patologia complessa causata dall’associazione di fattori genetici, ambientali e dall’età avanzata. Attualmente per queste patologie non sono disponibili né test diagnostici né cure. Scopo dello studio: L’obiettivo di questo progetto è lo sviluppo di test diagnostici validi per la caratterizzazione genetica dei pazienti affetti da IRD o OMD. Per tale scopo, 620 pazienti e familiari affetti sono stati clinicamente caratterizzati e dalla collezione dei loro DNA è stata creata una biobanca genetica disponibile per eventuali test genetici. In base alla patologia di cui sono affetti, i test diagnostici sono stati eseguiti mediante utilizzo di Sanger sequencing o Next Generation Sequencing (NGS) al seguito del quale sono stati realizzate delle correlazioni tra il genotipo e il fenotipo. Materiali e metodi: Dopo anamnesi clinica e approfondito esame visivo, i pazienti sono stati sottoposti a prelievo di sangue da cui è stato estratto il DNA stoccato all’interno della biobanca. In parallelo una biobanca retinica è stata generata dalla collezione di retine di domatori, raccolte in accordo alle normative vigenti. Lo screening genetico è stato eseguito su 190 pazienti affetti da differenti forme autosomiche recessive o dominanti di IRD, mediante la tecnologia targeted NGS, con pannelli di 25 geni. Dopo la selezione delle varianti o mutazioni identificate dall’analisi, è stato eseguito il sequenziamento Sanger per la loro conferma. La corretta attribuzione dei risultati agli individui analizzati è stata realizzata grazie alla comparazione di profili genetici ottenuti dal DNA della biobanca e quello residuo dall’analisi NGS. Lo screening genetico, dei pazienti affetti da forme X-linked di IRD (n=60) o da OMD (n=5) è stato ottenuto da sequenziamento Sanger dei geni RPGR e RP2 (IRD) o RP1L1 (OMD). Un test di suscettibilità genetica è stato sviluppato e applicato a 118 pazienti (39 dei quali precedentemente screenati con NGS), mediante real time PCR, per valutare l’espressione di 7 polimorfismi associati all’AMD nei soggetti affetti da IRD. Risultati: Con lo screening NGS 256 varianti/mutazioni sono state identificate in 126 pazienti. Tra queste il 49% è rappresentato da alterazioni non note in letteratura. I geni maggiormente mutati sono USH2A (15%) e ABCA4 (14%), mentre nessuna alterazione è stata riscontrata nei geni BEST1, CRX, LRAT and RLBP1. Il 27% dei casi è stato completamente risolto, mentre il 39% solo parzialmente, a causa dell’identificazioni di una sola mutazione recessiva o di varianti di significato incerto. Le varianti missenso coprono l'80% del totale, seguite dalle mutazioni nonsenso (9%), dalle inserzioni/delezioni frameshift (8%), dalle inserzioni/delezioni in-frame (2%) e dalle alterazioni di splicing (1%). La correlazione del genotipo identificato con il fenotipo diagnosticato è stata possibile in quasi la metà dei pazienti geneticamente caratterizzati. Dalla comparazione è stato possibile identificare forme trialleliche, con la mutazione missenso G1961E di ABCA4 come allele aggravante, e una nuova associazione gene-malattia per il gene PRPF31 che in tre pazienti causa la sindrome di Usher. L’analisi dei probandi affetti da forme X-linked di Retinite Pigmentosa ha permesso l’identificazione di un’inserzione framshift nell’ORF15 del gene RPGR, una mutazione nonsenso in RPGR gene e una mutazione missenso nota in RP2, in tre famiglie distinte. Tra i pazienti affetti da OMD, è stata identificato per due di essi la mutazione missenso S1199F in RP1L1. Il test di suscettibilità per i 7 SNP ha evidenziato un elevato alto genetico di AMD in 38 soggetti, medio alto in 16, medio in 36, e basso in 28. Conclusioni: La tecnologia NGS si è rivelata un utile strumento diagnostico per le forme autosomiche dominanti o recessive di distrofie retiniche, permettendo il sequenziamento massivo e parallelo di molti geni e pazienti. La percentuale di pazienti geneticamente caratterizzati è coerente con i dati presenti in letteratura. L’uso di un pannello di geni risulta essere un accettabile compromesso tra la i risultati ottenuti e le criticità legate alla grande quantità di dati output, rispetto alle analisi di whole genome o whole exome sequencing. Buona parte dei dati genetici sono stati correlati alle manifestazioni cliniche dei pazienti. La tecnologia Sanger, gold standard del sequenziamento, è ottimale per l’identificazione della causa genetica in tutte le patologie ove uno o pochi geni sono coinvolti, come le forme X-linked di IRD o la OMD. L’espressione di fattori di rischio, predisponenti alla degenerazione maculare, pur non correlando con la severità delle mutazioni confermate, potrebbe fornire importanti relazioni con le patologie di cui i soggetti sono affetti. L'identificazione delle cause genetiche di queste patologie porterà una nuova spinta nello sviluppo di nuove terapie geniche e cellulari, fondamentali per il trattamento delle patologie retiniche ereditarie.