Characterization of a novel FoxO-dependent atrogene

Muscle atrophy results from transcriptional adaptations occurring during aging (sarcopenia) and also in diseases such as cancer (cachexia), AIDS, denervation, sepsis, heart failure, diabetes, etc. Excessive muscle loss ultimately aggravates diseases and increases morbidity and mortality. An exacerbated activation of FoxO family members leads to increased protein breakdown and muscle wasting. Microarray analysis during fasting showed that FoxOs are required for the induction of several atrophy-related genes (atrogenes) that have important role in the autophagy-lysosome pathway, ubiquitin-proteosome pathway, unfolded protein response, mitochondrial function, etc.. However, the activation of the already identified atrogenes cannot sustain all the protein breakdown during atrophy. Indeed, the discovery of new unknown players involved in muscle protein degradation is now of potential interest. We identified several new FoxOs-dependent genes, here called RIKENs, whose functions were until now unrevealed. We showed that in particular one gene that we called RIKEN1 is up-regulated in catabolic condition such as fasting, disuse and cancer cachexia mouse models. This was also confirmed in cancer cachexia patient samples. Colocalization experiments in vitro and in vivo showed a Riken1GFP-LC3cherry interaction in the autophagosomes suggesting a potential role in the autophagy-lysosome pathway. Site-directed mutagenesis in the predicted LIR motifs of RIKEN1 allowed us to determine which of these motifs are involved in the interaction with LC3. Importantly, Knocking-down RIKEN1 protected from fasting-induced atrophy and overexpression of RIKEN1 induced atrophy suggesting that RIKEN1 is required and is sufficient for inducing muscle wasting. Moreover, autophagic flux was blocked when we knocked-down RIKEN1 by shRNA. On the other hand, its overexpression accelerated autophagic flux leading to more protein degradation and more atrophy. Our findings contribute to the identification and the characterization of a completely new FoxO-dependent mediator of muscle mass loss that plays a role in autophagy-lysosome system in order to develop new therapeutic approaches against muscle wasting.

L'atrofia muscolare è il risultato di adattamenti trascrizionali che avvengono durante l'invecchiamento (sarcopenia) e in diverse patologie come cancro (cachessia), AIDS, denervazione, sepsi, infarto o diabete, causandone un aggravamento e aumentando la morbidità e la mortalità. Una forte attivazione dei membri della famiglia FoxO porta ad un aumento della degradazione proteica e ad una conseguente perdita di massa muscolare. L’analisi dei microarray in condizioni di digiuno ha mostrato che FoxO è necessario per l'induzione di diversi geni correlati con l'atrofia (atrogeni) che hanno un ruolo importante in processi catabolici, quali ad esempio il meccanismo autofagia-lisosoma o la via ubiquitina-proteosoma, in diverse funzioni mitocondriali o nella risposta di stress cellulare causata dall’accumulo di proteine malpiegate all’interno del reticolo endoplasmatico (UPR). L’attivazione degli atrogeni già identificati e noti in letteratura non è comunque sufficiente a spiegare il livello di degradazione proteica osservata durante differenti condizioni di atrofia. La scoperta di nuovi e sconosciuti fattori coinvolti nel catabolismo di proteine muscolari può quindi essere un campo di potenziale interesse per prevenire la perdita di massa osservata in diverse patologie. Sono stati identificati diversi geni FoxO-dipendenti, qui chiamati RIKENs, le cui funzioni non sono ad ora note. Si è dimostrato in particolare che un gene, denominato RIKEN1, è overespresso in topi sotto diverse condizioni cataboliche come il digiuno, il disuso e la cachessia. Esperimenti sulla co-localizzazione effettuati in vitro e in vivo mostrano interazioni tra RIKEN1GFP e LC3cherry, suggerendo un potenziale ruolo di RIKEN1 nel meccanismo autofagico-lisosomiale. Il silenziamento di RIKEN1 con ShRNA, inoltre, ha portato ad una significativa protezione dalla perdita di massa muscolare indotta da un digiuno prolungato. Abbiamo anche osservato che silenziando RIKEN1 si ha un blocco del processo autofagico, in linea con la ridotta atrofia osservata. Al contrario un’over -espressione di RIKEN1 risulta in una significativa perdita di massa muscolare, dovuta ad un aumentato flusso autofagico e, quindi, ad una maggiore degradazione proteica, suggerendo, quindi, che RIKEN1 è necessario e sufficiente per indurre atrofia muscolare. Questi risultati hanno quindi portato all’identificazione e caratterizzazione di un gene FoxO-dipendente totalmente nuovo, che gioca un ruolo fondamentale nella via di degradazione autofagico-lisosomiale e che potrebbe essere di interesse per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici al fine di prevenire la perdita di massa muscolare.