Monitoring motions in relevant biological systems by means of Electron Paramagnetic Resonance

Biochemical patterns in living systems are based in several instances on mechanical events, resulting from proteins undergoing large amplitude motions triggered by chemical signals. Indeed, while performing their function, these proteins undergo some important conformational changes, which modulate the final outcome. A better knowledge of the systems and of the mechanisms regulating these motions is a key point in understanding the function of the proteins under exam. In particular, this thesis work is focused on the study of two relevant biological systems: the investigation on motor system proteins, like class II myosins, involved in the contractile function, and on a maturation protein involved in the correct assembly of the active site of a [FeFe]-hydrogenase. Myosin is one of the three molecular motors that are present in eukaryotic cell genome and, together with actin, it is responsible for muscle contraction. During the completion of its function, myosin undergoes large amplitude motions that result in a change of its biochemical state, causing the powerstroke which is necessary for muscle contraction. Point mutations and post-translational modifications of this protein lead to contractile dysfunctions and the organism can incur in severe diseases and damages. So far, myosin function and dysfunction have mainly been studied by means of parameters related to ATP hydrolysis or to mechanical output, without paying attention to the molecular motion in relation to protein structural alterations. The investigation of the mechanics of myosin at a molecular level, combined with the study of mechanical output such as force and shortening velocity, is required in altered systems for the rational design of drugs. This target, in fact, would be difficult to reach without a deeper understanding of alterations in the structure of the protein involved in the working of the system. [FeFe]-hydrogenases are enzymes that catalyze the reversible production of H2 in many bacteria and unicellular eukaryotes and several efforts are underway to understand how their complex active site (the H-cluster) is assembled. This site is characterized by a [4Fe4S]-2Fe cluster and its biosynthesis requires the cooperation of three conserved maturation proteins: HydE, HydF and HydG. Among them, HydF plays a central role in the whole maturation process, a double function of scaffold for the building of the H-cluster and carrier for the delivery of the mature prosthetic group to the hydrogenase, which is eventually converted in the active holo form. The protein contains a GTP-binding domain, in which the conformational changes related to the protein function still have to be defined at a molecular level, but they are certainly responsible for the interplay between partners in the maturation process. The topic gained a lot of scientific interest in recent years, as the bio-production of hydrogen is considered a clean source of energy, but its use is still limited for the high production costs. For these reasons, a deeper knowledge of the catalytic site assembly and functioning is required to improve the capability of hydrogen production. For the investigation on the conformational changes of both systems, Electron Paramagnetic Resonance (EPR), coupled with Site-Directed Spin Labeling (SDSL), is the election technique, as paramagnetic probes are sensitive to the rotational and internal dynamics in bio-molecules. In particular, Continuous Wave EPR (CW-EPR) enables to obtain information on the mobility and the dynamics of a nitroxide at a desired site, together with solvent accessibility, while Double Electron Electron Resonance (DEER) can be used to measure distances between couples of spins. In this way, possible conformational changes induced by stimuli in the proteins under investigation can be detected and models on the protein functionality may be proposed. In this thesis, EPR techniques have been applied in order to shed light on the molecular changes occurring in the systems upon different stimuli or mutations. To have a more complete overview on the events occurring in the mentioned proteins, complementary biochemical essays have also been carried out. Regarding the investigation on myosin, as a main result we were able to optimize a set-up to perform EPR experiments on muscle fibers, which allowed us to get insight into the structural modifications occurring in diseased systems; in particular, hypertrophy, atrophy and oxidation in mice muscles were examined. In the case of HydF, a detailed investigation on the structural changes promoted by the GTP-binding domain has been carried out. The results clearly show that the GTPase domain of HydF behaves as a small GTP switch, like a family of proteins that are involved in different biochemical pathways and that undergo conformational changes upon the binding of the nucleotide. The work presented in this thesis has been divided into three parts: in the first part, a general introduction on the importance of molecular motions in biological systems and an overview of the EPR techniques employed for the investigations will be given, while in the other two parts, the results obtained on the two systems that have been object of the present study will be discussed.

Molto spesso modelli biochimici in sistemi viventi sono basati su eventi meccanici, i quali sono il risultato di moti di grande ampiezza a cui sono soggette diverse proteine in seguito a stimoli chimici. Nel corso dell'esplicazione delle loro funzioni, infatti, queste proteine vanno incontro a variazioni conformazionali anche importanti, che ne regolano il comportamento finale. Un punto chiave per la comprensione della funzione di tali sistemi, pertanto, risulta essere una conoscenza più profonda degli stessi e dei meccanismi che regolano i loro moti. Il particolare, il lavoro contenuto all'interno di questa tesi è focalizzato allo studio di due sistemi biologici rilevanti: l'indagine su sistemi motore, come la classe della miosina di tipo II, coinvolta nella contrazione muscolare, e la ricerca riguardante una proteina di maturazione coinvolta nel corretto assemblaggio del sito attivo di una [FeFe]-idrogenasi. La miosina è uno dei tre motori molecolari che risultano essere presenti nel genoma delle cellule eucariotiche e, insieme all'actina, è responsabile della contrazione muscolare. Nel corso dell'esplicamento della sua funzione, la miosina va incontro a variazioni conformazionali che si traducono in una variazione del suo stato biochimico, provocando il motore biologico necessario alla contrazione. Mutazioni puntuali e modifiche post-traduzionali della miosina portano come conseguenza a disfunzioni contrattili e l'organismo può andare incontro a serie patologie e gravi danni. Finora, il corretto e l'alterato funzionamento della miosina sono stati principalmente studiati dal punto di vista di variazioni legate all'attività di idrolisi dell'ATP o al risultato meccanico, senza prestare particolare attenzione al dettaglio molecolare in relazione ad alterazioni strutturali della proteina. Lo studio della meccanica della miosina ad un livello molecolare, combinata all'indagine di parametri meccanici come produzione di forza e velocità di accorciamento delle fibre, risulta pertanto necessario in sistemi alterati per una progettazione oculata di farmaci per la cura di tali disfunzioni. Tale obiettivo, infatti, risulterebbe pressochè impossibile da raggiungere in assenza di una più profonda conoscenza delle alterazioni a livello strutturale della proteina coinvolta nel globale funzionamento del sistema. Le [FeFe]-idrogenasi sono enzimi che catalizzano la produzione reversibile di idrogeno in molti batteri ed eucarioti unicellulari, e numerosi sforzi vengono attualmente spesi per comprendere come il complesso sito attivo (denominato cluster H) sia assemblato. Il sito è caratterizzato dalla presenza di un cluster [4Fe4S]-2Fe la cui biosintesi richiede la cooperazione di tre proteine di maturazione conservate: HydFE, HydF e HydG. Tra queste, HydF ha un ruolo centrale nell'intero processo di maturazione, possiede infatti un doppio ruolo di scaffold per l'assemblaggio del sito attivo e di trasportatore del gruppo prostetico maturo all'idrogenasi vera e propria, che viene così convertita nella forma attiva. La proteina contiene un dominio per il legame del nucleotide GTP; le variazioni conformazionali di questo dominio, in relazione alla funzione espletata dalla proteina, devono ancora essere chiarite a livello molecolare, ma sono certamente responsabili dell'interazione tra le diverse proteine coinvolte nel processo di maturazione. Tale studio ha guadagnato un notevole interesse scientifico nel corso degli ultimi anni, poichè la bioproduzione di idrogeno è considerata una fonte pulita di energia, limitata tuttavia dagli alti costi di produzione. Per tali ragioni, una conoscenza più approfondita riguardo l'assemblaggio ed il funzionamento del sito catalitico è richiesta al fine di migliorare la capacità di produzione di idrogeno. La tecnica di risonanza paramagnetica elettronica (EPR), accoppiata a marcatura sito-specifica con sonde paramagnetiche, risulta essere la tecnica principe per quanto riguarda l'indagine delle variazioni conformazionali in entrambi i sistemi, dal momento che queste sonde sono sensibili alla dinamica rotazionale ed interna in molecole di interesse biologico. In particolare, EPR in onda continua permette di ottenere informazioni circa la dinamica di un nitrossido in un sito di interesse, oltre che informazioni sull'accessibilità dello stesso al solvente, mentre la tecnica DEER può essere utilizzata per misurare distanze tra coppie di spin. In questo modo, eventuali variazioni conformazionali indotte da diversi stimoli nei sistemi studiati possono essere studiate e si possono avanzare proposte riguardo un modello di funzionalità di queste proteine. In questa tesi, le diverse tecniche EPR sono state applicate in modo da gettare luce sulle variazioni a livello molecolare che avvengono in questi sistemi in seguito all'applicazione di diversi stimoli o mutazioni. Per avere una visione più generale sugli eventi che avvengono in queste proteine, le indagini sono state affiancate da test di funzionalità biochimica. Per quanto concerne lo studio sulla miosina, come risultato principale abbiamo ottimizzato un set-up per l'indagine spettroscopica di fibre muscolari, che ci ha permesso di approfondire lo studio di sistemi alterati; in particolare, lo studio si è concentrato su ipertrofia, atrofia ed ossidazione nei muscoli di topo. Nel caso di HydF, invece, si è svolta un'indagine dettagliata delle variazioni strutturali causate dal legame del GTP alla proteina. I risultati mostrano in modo inequivocabile che la maturasi in questione si comporta come altre proteine denominate GTP switches, le quali subiscono importanti variazioni conformazionali, fondamentali per la loro funzionalità, in seguito al legame del nucleotide. Il lavoro presentato in questa tesi è stato diviso in tre parti: nella prima parte, verranno date un'introduzione generale sull'importanza di moti molecolari che avvengono in sistemi biologici ed una panoramica sulle tecniche EPR utilizzate nello studio; nelle altre due parti, invece, verranno discussi i risultati ottenuti per i due sistemi che sono stati oggetto del presente lavoro.