Molecular studies for disclosing the genetic identity of local cultivars in olive and understanding the stilbene synthase pathway in grapevine

This study has been focused on two main fruit trees, olive and grapevine, from the genetic and genomic point of view. Olive (Olea europaea L.) is one of the oldest tree crops of the Mediterranean regions. In spite of the increasing economic importance and wider diffusion of monovarietal virgin olive oils, very few studies have focused on the genetic characterization of olive cultivars locally grown in the Veneto region, North-Eastern Italy. Since the genotype mainly affects the composition and sensory properties of extra virgin olive oils, the characterization of autochthonous olive cultivars is a key step for the production, marketing and traceability of high quality olive oils. Here we have performed a survey of mapped SSR marker loci for the analysis of nuclear DNA polymorphisms to distinguish olive cultivars and cultivar groups within the entire olive cultivation area in Veneto, from the Garda Lake to the Euganean and Trevisan hills, in order to obtain a systematic examination of the Veneto regional olive germplasm patrimony. The final aim of the study was to resolve cases of homonymy and synonymy, and to warrant the genetic authenticity of olive cultivars and of their clones in case of mislabelling. A total of 204 unknown olive tree accessions along with 25 olive reference cultivars were subjected to molecular analyses using ten highly polymorphic nuclear SSR markers. The overall molecular data were used for the computation of genetic similarity and diversity statistics, for the construction of ordination dendrograms and the determination of centroids of local accessions, along with reference cultivars. A genetic structure analysis of the olive population as a whole was also performed for the definition of cultivar groups. Based on multi-locus SSR genotypes and pair-wise SM coefficients, we found that on one hand most of the olive samples displayed genetic identity with the reference cultivars “Casaliva” (60 samples) while several others showed identity with different national and local varieties: “Miniol” (21 samples), “Grignano” (20 samples), “Tonda di Villa” (19 samples), “Leccino” and “Capolga” (17 samples each), “Gargnà”, “Compostaro” and “Oblica” (9 samples each), “Rossanel” (8 samples), “Fort” and “Baia” (5 samples each), “Grappolo” and “Favarol” (3 samples each) having bootstrap values greater than 85%. As few as 2 samples were attributable to “Moraiolo”, “Carnica” and “Maurino” each. The uppermost hierarchical level of population structure suggested a clear maximum of cultivar groups for K=15. It is worth noting that more than 98% of individual trees revealed a pure ancestry and only 13 accessions were admixed showing a membership to the associated cultivar group <70%. The total value of observed heterozygosity was equal to Ho=91.6% (st. dev. 1.9%). and the mean expected heterozygosity was He=74.1% (st. dev. 2.9%). Moreover, the Nei’s unbiased genetic diversity was as equal to uHe=74.3%, whereas the total estimate of the Shannon’s information index of phenotypic diversity was equal to I=1.612. The fixation index, equal to Fst=0.247, revealed that only less than 25% of the genetic variation was found among cultivar groups and that approximately as much as 75% of the total polymorphism was scored among trees within cultivar groups. The narrow genetic differentiation among subgroups over the investigated multi-locus marker loci was confirmed by the gene flow estimate that was as low as Nm=0.412. It is worth mentioning that all Wright’s inbreeding coefficients were negative and on average equal to Fis=–0.863 and Fit=–0.159, indicating a significant excess of heterozygosity for the olive accessions of the Veneto germplasm. Overall, the SSR markers used in this study have shown their efficacy to distinguish cases of homonymy, synonymy and mislabelling, providing the first systematic analysis of olive germplasm for horticultural valorisation of Veneto cultivars in the regional areas most suited for typical monovarietal virgin olive oil productions. For what concerns grapevine, plant stilbenes are a small group of phenylpropanoid (PP) compounds that have been detected in a limited number of unrelated plant species of at least 72 including grapevine. Plants accumulate it in leaves, roots and fruits in response to both biotic and abiotic stresses such as mechanical wounding, UV-C exposure, pathogen infection, and chemicals treatment. In the last decade stilbenes had raised the interest of many scientists not only because of their role in the plant protection against environmental stresses, but also because of their pharmacological properties. The biosynthetic pathway leading to their production is a side branch of the general PP biosynthetic pathway and can be considered as an extension of the flavonoid pathway. Stilbene synthase (STS) is the key enzyme leading to the biosynthesis of resveratrol which is the basic unit of the biosynthesis of plant stilbenes. Recently we reported the identification and functional characterization of two grapevine R2R3-MYB transcription factors (TFs), which appear to regulate the stilbene biosynthetic pathway. These TFs, designated VvMYB14 and VvMYB15, strongly co-express with VvSTS genes under a range of stress-induced conditions and in developmentally regulated tissues, including leaves exposed to wounding treatment, UV-C irradiation and downy mildew infection, and several stages of seed and berry development. In transient gene reporter assays, these VvMYB TFs were demonstrated to specifically activate the promoters of VvSTS genes, and the ectopic expression of VvMYB15 in grapevine hairy roots resulted in increased VvSTSs expression and in the accumulation of glycosylated stilbenes in planta. However, despite these significant advances, many question remain to be answered regarding this grapevine biosynthetic pathway. Based on the notion that genes involved in similar or related processes may exhibit similar expression patterns over a range of experimental conditions, we performed a co-expression network analysis on different grapevine gene expression datasets identifying candidate TFs belonging to the WRKY family possibly involved in the regulation of the stilbene biosynthetic pathway. These genes show co-expression correlation values even higher than those observed for VvMYB14/15 and are strongly induced in response to the same abiotic stress treatments which lead to VvSTS induction. The expression of candidate WRKY TFs, namely WRKY03, WRKY43 and WRKY53 together with the expression of the two MYBs already characterized (MYB14 and MYB15) and VvSTSs genes was monitored in different stress conditions, including wounding and UV-C treatment, in order to confirm data obtained from co-expression analyses in whole transcriptome datasets. Results confirmed that there is a strong correlation between the expression of candidate WRKY genes and VvSTSs suggesting a role for these TFs in the regulation of the stilbene pathway. In order to confirm this hypothesis, we performed several functional studies. Amongst them, of particular interest are those results obtained from dual reporter luciferase assays. These assays were aimed at measuring the activity of the WRKY TFs on the VvSTS promoters by mean of transfection experiments in grapevine liquid cell cultures. Interestingly our results indicate a role for VvWRKY43 and WRKY53 in the regulation of VvSTSs. Nevertheless, these TFs seem to act exclusively in combination with MYB14 and MYB15, since, whenever co-transfected alone, they did not show any significant effect on the VvSTS promoter. Differing from WRKY43 and WRKY53, WRKY03 did not show any effect on the VvSTS promoter activity neither alone nor in combination with R2R3-MYB TFs, but was demonstrated to induce the promoter of VvMYB14. Then, our results indicate that WRKY03 probably act upstream R2R3-MYB factors in the regulation of the grapevine STS pathway whereas WRKY43 and WRKY53 have a role as co-factors with VvMYB14 and VvMYB15 TFs.

L’olivo e la vite sono l’oggetto della dissertazione, condotta da un punto di vista genetico e genomico, illustrata nel presente lavoro. L’olivo (Olea europaea L.) è uno degli alberi da frutto più antichi dell’intera area Mediterranea. Nonostante la crescente importanza economica di questa specie e la sempre più ampia diffusione di oli extra-vergine di oliva monovarietali, pochi sono gli studi riguardanti la caratterizzazione genetica degli alberi di olivo tipici della regione Veneto. Poiché la composizione e le proprietà sensoriali degli oli extra-vergine di oliva sono influenzate principalmente dal genotipo, la caratterizzazione di cultivar autoctone di olivo rappresenta una fase cruciale per la produzione, la commercializzazione e quindi l’autenticazione di oli d’oliva di alta qualità. A questo scopo, alcuni loci di marcatori microsatelliti mappati in varie regioni del genoma sono stati analizzati così da distinguere, sulla base di polimorfismi legati al DNA nucleare, diverse varietà di olivo coltivate in Veneto, dal lago di Garda fino a colli Trevigiani, passando per i colli Euganei, valutando così in modo sistematico l’intero germoplasma della regione. L’obiettivo finale del presente lavoro è stato risolvere alcuni casi omonimia e sinonimia nonché garantire l’autenticità di cultivar di olivo e dei loro cloni. Un totale di 204 accessioni prive di una chiara assegnazione varietale e 25 varietà di referenza sono state analizzate saggiando 10 marcatori microsatelliti di loci nucleari altamente polimorfici. Un’analisi della struttura genetica della popolazione è stata eseguita al fine di definire il numero di gruppi e la loro diversità genetica. Sulla base dei coefficienti di similarità genetica, una cospicua parte delle accessioni (60 campioni) si è dimostrata geneticamente identica alla varietà di referenza “Casaliva” mentre altri genotipi sono risultati geneticamente identici a varietà nazionali e locali tra cui “Miniol” (21 campioni), “Grignano” (20 campioni), “Tonda di Villa” (19 campioni), “Leccino” e “Capolga” (17 campioni ciascuna), “Gargnà”, “Compostaro” e “Oblica” (9 campioni ciascuna), “Rossanel” (8 campioni), “Fort” e “Baia” (5 campioni ciascuna), “Grappolo” e “Favarol” (3 campioni ciascuna), con supporto statistico di bootstrap superiore all’85%. Soltanto sei campioni, due per ciascuna cultivar, si sono rivelati attribuibili a “Moraiolo”, “Carnica” and “Maurino”. L’analisi della struttura genetica della popolazione analizzata ha evidenziato di essere costituita da 15 sottogruppi. Merita sottolineare che più del 98% delle accessioni ha mostrato una netta appartenenza ad uno di questi sottogruppi e solo 13 accessioni hanno rivelato una discendenza mista, con valori di appartenenza ad uno dei sottogruppi inferiore al 70%. La quota totale di eterozigosi osservata è risultato pari a Ho = 91,6% (st. dev. 1,9%) mentre l’eterozigosi media attesa è risultata pari a He = 74,1% (st. dev. 2,9%). L’indice di diversità genetica di Nei è risultato pari a uHe=74,3% mentre l’indice di Shannon sulla diversità fenotipica dei profili molecolari è risultato pari a I=1.612. Tutti i coefficienti di inbreeding di Wright si sono rivelati negativi e, in media, uguali a -0,863 (Fis) e -0,159 (Fit). Nel complesso i marcatori microsatelliti impiegati in questo studio si sono dimostrati estremamente efficienti nella risoluzione dei casi di omonimia, sinonimia ed errata identificazione consentendo così la prima vera analisi sistematica del germoplasma di olivo della regione Veneto finalizzata alla valorizzazione delle varietà locali più adatte alla produzione di oli di oliva monovarietali. Il secondo capitolo del presente lavoro si è focalizzato sulla pianta della vite ed in particolare sugli stilbeni, un gruppo di composti secondari appartenenti alla famiglia dei fenilpropanoidi accumulati in un numero limitato di piante (72) tra cui vite. Generalmente questa classe di fenilpropanoidi è accumulata nelle foglie, nelle radici e nei frutti in risposta a stress abiotici e biotici quali ferita, esposizione a raggi UV-C, infezione da patogeni e trattamenti chimici. Negli ultimi decenni l’interesse verso gli stilbeni è andato progressivamente aumentando, non solo in virtù del ruolo fondamentale che assumono nella difesa della pianta da stress ambientali, ma anche per le loro proprietà farmacologiche. La via metabolica dedita alla produzione di questi composti rappresenta una diramazione della pathway biosintetica che porta alla produzione dei fenilpropanoidi e può essere considerata un’estensione della via metabolica che flavonoidi. La stilbene sintasi è l’enzima chiave nella produzione di resveratrolo, composto alla base della biosintesi degli stilbeni complessi. Recentemente abbiamo identificato e caratterizzato funzionalmente due fattori di trascrizione di tipo R2R3-MYB che, in vite, sono direttamente coinvolti nella regolazione della via metabolica degli stilbeni. Questi fattori di trascrizione, denominati VvMYB14 e VvMYB15, co-esprimono con le VvSTS in diverse condizioni di stress (stress meccanico, radiazioni UV-C, attacco fungino) e in alcune fasi di sviluppo del seme e della bacca. In saggi reporter, MYB14 e MYB15 hanno mostrato un coinvolgimento diretto nell’attivazione dei promotori dei geni VvSTS e l’espressione ectopica di VvMYB15 in hairy root ha rivelato un incremento nell’espressione dei geni VvSTS nonché l’accumulo di stilbeni glicosilati (piceidi) in planta. Tuttavia, nonostante i risultati incoraggianti, diverse sono le questioni rimaste insolute in relazione a questa via biosintetica. Partendo dal presupposto che geni coinvolti in processi affini o strettamente correlati possono esibire, in condizioni sperimentali controllate, profili di espressione simili, alcune analisi di co-espressione, eseguite su alcuni dataset di espressione in vite, hanno permesso di identificare fattori di trascrizione candidati, appartenenti alla famiglia WRKY, che potrebbero essere coinvolti nella regolazione della via biosintetica degli stilbeni. Questi geni hanno mostrato valori di correlazione, in termini di co-espressione, persino più alti di quelli osservati per VvMYB14 e VvMYB15 e si sono rivelati marcatamente indotti a seguito degli stessi stress che portano all’induzione di VvSTS e dei MYB14/15. Le analisi di correlazione su database pubblici, la validazione della co-espressione dei WRKY candidati e VvSTSs in diverse cinetiche di stress e la caratterizzazione funzionale tramite saggio luciferasi in colture cellulari di vite hanno permesso di aggiungere nuovi tasselli ai meccanismi regolatori che stanno alla base della pathway biosintetica che porta alla sintesi degli stilbeni.