Development of computational methods for the analysis of conductance and unitary permeability of channels formed by connexins involved in hereditary deafness

This Ph.D. research project focused on the study of channels composed of connexin 26 (Cx26) protein subunits. In particular, we analyzed conductance, permeability and/or structural differences of deafness-related mutations of Cx26 intercellular gap junction channels or unpaired hemichannels, using different molecular dynamics approaches and statistical mechanics. The first part of this thesis introduces the structure of gap junction channels and the connexin proteins that form them. Next, it dwells on the function of gap junction channels and connexin hemichannels, particularly on their conductance and permeability, two fundamental properties explored in the rest of the work. This introductory section contains also a brief overview of electrophysiology experiments performed on connexin channels. It ends with a section on gating properties that modify conductance state and a discussion of disease-related connexin mutations. The second part presents the key results obtained during this Ph.D. work, beginning with the full atom model on which the work was based, and a discussion of the improvements achieved during this project. The rest of the results are subdivided into three topics: (a) structural analysis, (b) conductance and (c) permeability. a) This section summarizes the results obtained for the mutant Cx26 C169Y, the analysis of which shows a large displacement of the extracellular loops and, consequently, of residues critically involved in hemichannel docking. b) This section introduces two methods to compute the ionic conductance of a connexin hemichannel and applies them to three different models: the mutant Cx26 M34T, the WT Cx26 hemichannel in a Coarse-Grained representation and the full-atom WT hemichannel model bound to an antibody. c) This section starts with the explanation of the method used to compute the potential of mean force (PMF) for the passage of a molecule through the channel pore and a possible interpretation of this potential. The PMF was then used to quantify permeation of different molecules (IP3, ATP) through Cx26 WT and V84L mutant hemichannels. The chapter ends with a structural analysis which accounts for the differences in the permeability of the two models. This thesis also contains an overall discussion of the results highlighted above and a methodological appendix.

Questo progetto Ph.D. si è concentrato sullo studio dei canali di membrana composti dalla proteina connessina 26 (Cx26). In particolare, abbiamo analizzato la conduttanza, la permeabilità e/o differenze strutturali di mutazioni correlate a sordità di canali di giunzione Gap Cx26 o emicanali, utilizzando diversi approcci di dinamica molecolare e meccanica statistica. La prima parte di questa tesi presenta la struttura dei canali di giunzione gap e le ​​connessine che li formano. Successivamente, si sofferma sulla funzione dei canali giunzione gap e emicanali di connessine, in particolare sulla loro conduttanza e permeabilità, due proprietà fondamentali esplorate nel resto del lavoro. Questa sezione introduttiva contiene anche una breve panoramica di esperimenti di elettrofisiologia condotti sui canali connessina. Si conclude con una sezione sulle proprietà di gating che modificano lo stato di conduttanza e una discussione sulle mutazioni della connessina correlate a malattie. La seconda parte presenta i principali risultati ottenuti nel corso di questo dottorato, a partire dal modello full atom su cui si basa il lavoro, e una discussione dei miglioramenti ottenuti durante questo progetto. Il resto dei risultati sono suddivisi in tre temi: (a) analisi strutturale, (b) conduttanza e (c) permeabilità. a) Questa sezione riassume i risultati ottenuti per il mutante Cx26 C169Y, la cui analisi mostra un grande spostamento delle spire extracellulari e, conseguentemente, dei residui criticamente coinvolti nell-aggancio degli emicanali. b) In questa sezione introduce due metodi per calcolare la conduttanza ionica di un emicanale di connessina e li applica a tre diversi modelli: il mutante Cx26 M34T, l-emicanale WT Cx26 in una rappresentazione a grana grossa (coarse grained) e il modello di emicanale WT full-atomo legato ad un anticorpo. c) Questa sezione inizia con la spiegazione del metodo utilizzato per calcolare il potenziale della forza media (PMF) per il passaggio di una molecola attraverso il poro del canale e una possibile interpretazione di questo potenziale. Il PMF è stato poi utilizzato per quantificare la permeazione di molecole diverse (IP3, ATP e glucosio) attraverso Cx26 WT e l-emicanale mutante V84L. Il capitolo termina con un'analisi strutturale che rappresenta le differenze nella permeabilità dei due modelli. Questa tesi contiene anche una discussione generale dei risultati evidenziati sopra e una appendice metodologica.