Design, Synthesis and Characterization of Polycyclic and Heteropolycyclic Compounds as Biologically Active Agents

The research projects described in this thesis are part of numerous collaborations with different scientific groups of italian and foreign universities but all aim at identifying, synthesising and validating new chemical structures as potential pharmacological agents for the treatment of several diseases (bacterial, cancerous, autoimmune or parasitic). All the projects are extremely multidisciplinary, and this gave me the chance to extend my knowledge towards new subjects, not strictly related to my educational background and at the same time to understand the complexity of medicinal chemistry, in all its facets. My principal task was to design and synthesise new chemical compounds with a polycyclic and hetero-polycyclic structure employing conventional and non-conventional synthetic methodologies. The high degree of diversity of these projects lead me to study and explore a considerable variety of chemical structures and functional groups, allowing me to learn and understand a very complex matter, but at the same time very fascinating, such as the organic chemistry applied to the pharmaceutical area. Beside the more theoretical knowledges related to the synthesis planning, this thesis is also marked by the strong impact and effort due to the laboratory practical for the preparation and physico-chemical characterization of the synthesised derivatives, which allowed me to deepen the understanding of fundamental spectroscopic and spectrometric techniques such as NMR and mass spectrometry. Moreover, the biological evaluation of the synthesised compounds played a crucial role in all this works and I am very grateful to the researchers with whom I had the chance to collaborate. A brief description of the major results presented in the various chapters follows. Chapter 1. Diflunisal, an old anti-inflammatory drug with a salicylic structure, has been recently repurposed for its capacity of sensitising methicillin-resistant Staphylococcus aureus to the action of methicillin. The major drawbacks related to the use of this drug in the antibacterial therapy are related to the anti-inflammatory mechanism of action, which can lead to gastrointestinal lesions, and to the poor water solubility. For this reasons we designed and synthesised some aza-analogs of diflunisal, following a synthetic route involving the obtainment of key oxazole intermediates and which exploit the Diels-Alder reaction to generate a small library of hydroxy-pyridine-carboxylic acids, variously substituted. From the biological investigation, the synthesised derivatives showed no cytotoxic activity, but some of them presented interesting anti-inflammatory and anti-bacterial properties, sensitising the bacteria S. aureus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecium e Pseudomonas aeruginosa to the action of some common antibiotics. Chapter 2. In the last ten years, we have been developing 7-phenyl-pyrroloquinolinones derivatives as a class of compounds which showed interesting anticancer properties. These compounds act as tubulin polymerization inhibitors and numerous derivatives have already been synthesised allowing the comprehension of the structure-activity relationships. The major problem of these compounds is their poor metabolic stability due to multiple oxidations. For this reason, we designed and synthesised some fluorinated derivatives to explore the effect of this element on the biological activity and on the metabolic stability. The biological evaluation includes in vitro cytotoxic activity, tubulin polymerization inhibition assays, metabolic stability test and two in vivo experiment on a murine model of melanoma. Chapter 3. RORγt, an isoform of the retinoic acid-related orphan receptor gamma has been identified as the master regulator of T-helper 17 (TH17) cell function and development, making it an attractive target for the treatment of autoimmune disorders. By exploring the structures of natural and synthetic steroidal ligands and of arotinoids ligands, we designed a hybrid structure as lead compound and we generated a small library of analogs, taking advantage of the Friedel-Crafts and Suzuki reactions. Cytotoxic assays, estrogenic activity and modulation of RORγt activity were evaluated. The compounds demonstrated to be less potent than ursolic acid used as reference, but still represent a good starting point in the development of RORγt inverse agonists with a steroidal scaffold. Chapter 4. The work described in this chapter was performed during a 6-months research period spent in the molecular modelling laboratory of professor Andrea Brancale at Cardiff University (UK). The trans-membrane receptor Notch and its signalling system are key factors in the development and homeostasis maintenance of most tissues. An irregular activity of this system represents one of the principal driver in the pathogenesis and progression of cancer diseases, especially leukemia. Notch activity is highly context-dependent; indeed, it shows oncogenic and tumour-suppressor roles. Thus, its modulation represents a concrete therapeutic possibility, but still no molecules that directly interact with Notch receptor are proceeding in the clinical phases at the moment. For this reasons, we decided to take in consideration two different binding sites and to perform a molecular modelling study to identify new possible ligands. Different virtual screening study were performed, both structure-based and ligand-based and at the end, 62 molecules from different commercial database were selected and purchased for the biological evaluation. From the biological screening, it was possible to identify two new hit compounds, which will be subject to further hit-to lead optimization studies. Chapter 5. Chagas disease is a neglected tropical disorder caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. The actual treatment consists in the administration of benznidazole or nifurtimox, two old anti-parasitic agents, which present several side effects and limited efficacy, especially in the chronic phase of the disease. An interesting molecular target for the treatment of the infection is represented by the enzyme Trypanothione reductase (TryR), which is responsible for the parasite’s defence against oxidative stress. TryR inhibition increases the susceptibility of T. cruzi towards anti-parasitic drugs, probably allowing a reduction in the dosage and thus a major success of the therapy. A virtual screening study on the structure of TryR was performed, and again the β-carboline scaffold was confirmed as a key core for the rational design of new inhibitors. The multistep synthesis, involving Pictet-Spengler and amidic coupling reactions, of 7 derivatives was successfully completed, and the biological evaluation is ongoing at the Universidad Metropolitana de Ciencias de la Educacion (UMCE), Santiago, Chile.

L’attività di ricerca descritta in questa tesi di dottorato si inserisce all’interno di progetti avviati con diversi ricercatori presso Università sia italiane che estere e hanno come scopo principale l’identificazione, la sintesi e la validazione di nuove piccole molecole quali potenziali agenti farmacologici per il trattamento di diverse patologie: batteriche, antiparassitarie, tumorali e autoimmuni. I progetti presentano delle caratteristiche marcatamente multidisciplinari e questo ha permesso di estendere le mie esperienze ad ambiti non strettamente inerenti alla mia formazione curriculare e conseguentemente di acquisire consapevolezza della complessità della chimica farmaceutica nelle sue varie accezioni. La mia principale attività è consistita nella progettazione e sintesi chimica di composti organici a struttura policiclica ed etero-policiclica applicando metodi di sintesi classici ed avanzati. La diversità dei progetti mi ha indotto ad affrontare e approfondire lo studio di nuove procedure di sintesi organica fondamentali per l’ottenimento di una grande varietà di strutture chimiche proposte come potenziali farmaci. Accanto allo studio per la progettazione dei percorsi sintetici, questa tesi di dottorato è contraddistinta dalla grande mole di lavoro sperimentale in laboratorio come si evince dall’elevato numero di composti intermedi e finali ottenuti e che sono stati purificati e compiutamente caratterizzati da un punto di vista chimico-fisico. Pertanto, anche le mie competenze riguardo l’uso di strumentazioni presenti e non nel Dipartimento di Scienze del Farmaco si sono notevolmente consolidate, in particolare ho potuto approfondire le tecniche di indagine spettroscopica più diffuse ed essenziali nell’ambito della chimica farmaceutica come la spettroscopia NMR e la spettrometria di massa. La maggior parte dei composti da me preparati in laboratorio sono già stati studiati anche per la loro attività biologica allo scopo di valutarne il potenziale farmacologico e per questo sono molto grato ai ricercatori con cui ho proficuamente collaborato. Segue una breve descrizione dei risultati ottenuti nei vari capitoli. Capitolo 1. Diflunisal, un noto farmaco antiinfiammatorio della categoria dei salicilati, è stato recentemente riproposto come agente in grado di sensibilizzare lo Staphylococcus aureus meticillino-resistente all’azione della meticillina. I principali problemi legati all’utilizzo di questo farmaco nella terapia antibiotica sono legati al meccanismo d’azione antiinfiammatorio, che può condurre a lesioni gastrointestinali anche gravi, e alla scarsa solubilità in acqua. Per queste ragioni abbiamo progettato e sintetizzato degli aza-analoghi del diflunisal, seguendo una via sintetica che prevede l’ottenimento di intermedi ossazolici e l’applicazione della reazione di Diels-Alder per generare così una libreria di analoghi acidi idrossi-piridin-carbossilici variamente sostituiti. A seguito della valutazione biologica i composti sintetizzati non presentano attività citotossica ed alcuni di loro presentano interessanti proprietà antinfiammatorie e soprattutto antibatteriche, sensibilizzando i batteri S. aureus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecium e Pseudomonas aeruginosa all’azione di alcuni antibiotici. Capitolo 2. I 7-fenilpirrolochinolinoni (7-PPyQ) appartengono alla famiglia dei pirrolochinolinoni, una classe di composti che ha rivelato in anni recenti interessanti proprietà antitumorali. In particolare, alcuni derivati del 7-PPyQ agiscono come forti inibitori della polimerizzazione della tubulina e dimostrano grande affinità per il sito della colchicina. I dati ottenuti dallo studio di numerosi derivati hanno consentito la comprensione delle relazioni struttura-attività. Il problema principale di questi composti è dovuto alla scarsa stabilità metabolica in seguito ad ossidazioni multiple. Per questo motivo sono stati progettati e sintetizzati alcuni derivati inserendo l’atomo di fluoro in diverse posizioni allo scopo di esplorare l’influenza di questo elemento sull’attività biologica e sulla stabilità metabolica. La valutazione biologica comprende i test di citotossicità in vitro e antitumorale in vivo su modello murino di melanoma., saggi di inibizione della polimerizzazione della tubulina e ovviamente i test in vitro di stabilità metabolica. Capitolo 3. Il recettore nucleare RORγt, un’isoforma del recettore orfano correlato ai recettori dell’acido retinoico ROR, è stato identificato come principale responsabile dell’attività e dello sviluppo dei linfociti T-helper 17 (TH17), i quali sono implicati nella patogenesi di alcune malattie autoimmuni. Questo rende RORγt un bersaglio ideale per il trattamento di queste patologie. Esplorando la struttura dei ligandi steroidei naturali e sintetici di questo recettore e dei ligandi arotenoidi, è stata progettata una struttura ibrida come lead compound e generato una piccola libreria di analoghi, sfruttando in particolar modo le reazioni di Friedel-Crafts e di coupling di Suzuki. Saggi di citotossicità, attività estrogenica e modulazione dell’attività del recettore RORγt sono stati effettuati. I composti risultano essere meno potenti dell’acido ursolico, agonista inverso usato come riferimento, ma rappresentano un buon punto di partenza per lo sviluppo di nuovi agonisti inversi del recettore RORγt, a struttura steroidea. Capitolo 4. L’attività descritta in questo capitolo è stata possibile grazie ad un periodo di 6 mesi trascorso presso il laboratorio di modellistica molecolare del professor Andrea Brancale presso Cardiff University (UK). Il recettore trans-membrana Notch e il suo sistema di signalling sono fattori chiave nello sviluppo e mantenimento dell’omeostasi in molti tessuti. Un’attività irregolare di questo sistema rappresenta uno dei principali driver nella patogenesi e progressione di molte forme tumorali, in particolar modo leucemiche. L’attività di Notch è fortemente dipendente dal contesto, infatti presenta caratteristiche sia di oncogene che di oncosoppressore. La sua modulazione rappresenta quindi una possibilità terapeutica concreta. Ad oggi, non esistono molecole in clinica che agiscono direttamente sul recettore Notch, per questo motivo prendendo in esame due diversi binding sites, è stato effettuato uno studio di modellistica molecolare adiuvato da simulazioni di docking per identificare nuovi possibili ligandi. Sono stati realizzati diversi studi di virtual screening, sia con approccio structure-based che ligand-based, e 62 molecole provenienti da diversi database commerciali, sono state selezionate per la valutazione biologica. Dai risultati ottenuti è stato possibile identificare due hit compounds, i quali verranno sottoposti a ulteriore indagine in futuri studi di hit-to-lead optimization. Capitolo 5. La malattia di Chagas è una malattia tropicale negletta causata dal protozoo Tripanosoma cruzi. Attualmente, viene trattata mediante somministrazione di benznidazolo o nifurtimox, due vecchi agenti antiparassitari, che presentano molti effetti collaterali e limitata efficacia, soprattutto nella fase cronica dell’infezione. Un possibile bersaglio molecolare per il trattamento dell’infezione è rappresentato dall’enzima Tripanotione Reduttasi (TryR), responsabile della difesa del parassita contro lo stress ossidativo. L’inibizione di questo enzima incrementa la suscettibilità di T. cruzi nei confronti dei farmaci antiparassitari, probabilmente consentendo una riduzione del dosaggio e un maggiore successo della terapia. Uno structure-based virtual screening sulla struttura di TryR è stato effettuato confermando lo scaffold β-carbolinico come cruciale per la progettazione razionale di nuovi inibitori. La sintesi multi-step, comprendente reazione di Pictet-Spengler e coupling ammidico, è stata completata con successo per 7 derivati e al momento i composti sono sottoposti a valutazione biologica presso l’Universidad Metropolitana de Ciencias de la Educacion (UMCE), Santiago, Chile.