Genetics in TNF-TNFR pathway: a complex network causing spondyloarthritis and conditioning response to therapy

Background. The seronegative spondyloarthritis (SpA) are a group of chronic inflammatory diseases resulting from a complex interplay among genetic background (mainly represented by HLA-B27) and environmental factors, that leads to the activation of autoinflammation and the dysregulation of the immune-system. In many cases, an early diagnosis and an appropriate monitoring of disease activity can be difficult because of the overlap of clinical features. Furthermore, because of the indices of inflammation, erythrocyte sedimentation rate (ESR) and C-reactive protein (CRP), are in the normal range in at least half of SpA patients with a clear expression of disease activity, a delay in diagnosis and consequently in treatment in these patients has been documented. This imparts a tremendous symptomatic burden and loss of function in these patients during the productive years of life. For all these reasons, much attention is currently devoted to the identification of biochemical and genetic biomarkers to be used in the diagnosis as well as prognostic factors in evaluating the treatment effectiveness. Among the genetic predisposing factors, a well-known role is that of HLA-B27, which contributes however to only 20–30% of the total heritability, whereas the whole major histocompatibility complex (MHC) accounts for about 40–50% of the genetic risk of developing SpA. This suggested that other genes are involved in pathogenetic mechanism. In fact, in addition to HLA-B27, a number of genetic factors in both, MHC and non-MHC locus, have been claimed to play a role in pathogenesis of SpA. In this context, because of TNF-α is primarily involved in the propagation and perpetuation of inflammation in SpA, the study of TNF-α genetic is of great interest. Several polymorphisms (SNPs) in genes involved in TNF-α signalling, as TNFA, TNFSF15, TNFR1 and TRADD genes, have been identified as associated with SpA, even if results are controversial. Of great interest are also variants in MEFV gene, involved in the pathogenesis of the autoinflammatory disorder Familial Mediterranean Fever (FMF). Recent studies have shown that the SpA, and in particular the ankylosing spondylitis (AS), are very common among patients affected by FMF and that these patients can present with AS as a sole manifestation. The present study, conducted in a cohort of 91 SpA patients and 223 controls, coming from a North-East Italian region, was aimed to identify biohumoral (biochemical and haematological) and genetic factors to support the diagnostic and prognostic (response to therapy) work-up of SpA diseases. In particular, in addition to biochemical and haematological indices, we investigated whether SNPs in the promoter region of TNFA, or SNPs in the autoinflammatory TNFRSF1A and MEFV genes, might concur with HLA-B27 in enhancing the risk of developing SpA disease and/or in predicting the response to anti-TNFα drugs. Methods. The study population comprised 91 patients with a diagnosis of SpA (mean age ± standard deviation: 52.1 ± 12.5 years; 57 males, 34 females) and 223 blood donors (mean age ± standard deviation: 46 ± 11 years; 146 males, 77 females) coming from Veneto Region, a North-East Italian region. Among patients, 36 had a diagnosis of AS and 55 patients of psoriatic arthritis (PsA), which were based on New York and CASPAR criteria respectively. The protocol of this study was approved by the Local Institutional Ethic Committee of University-Hospital of Padua, Italy (Prot.n. 3024P/13), and all participants gave written informed consent before entering the study. Demographic and physiological data, medical and familial history data were collected for each participant. Blood samples were collected and complete blood count, CRP, ESR, uric acid, prealbumin, alanina aminotransferase (ALT) and glucose were evaluated. Direct sequencing of MEFV (exons 2,3,5 and 10) and TNFRSF1A (exons 2,3,4 and 6) genes were performed. HLA-B27 and TNFA polymorphisms (-1031T>C;-857C>T;-376G>A;-308G>A;-238G>A) were assayed by Real Time-PCR. HLA-CW6 allele presence was analysed by molecular genetic testing using a commercially available CE-IVD microarray. Statistical analysis was performed using STATA software (version 13.1). Results. An higher number of circulating polymorphonuclear cells and higher CRP levels could be detected in SpA patients with respect to controls, and in PsA higher levels of ALT could be observed with respect not only to controls but also to AS. Anyway these indices were not highly elevated and often comprised within the reference intervals. As expected, HLA-B27 was associated with AS (χ2=120.1; p<0.0001). Although a slightly higher frequency of HLA-CW6 carriers was observed among patients with AS (about 6%) or PsA (about 13%) with respect to controls (about 4%), the difference was not statistically significant. Any single studied TNFA SNP was not associated with SpA diagnosis, nor with AS or PsA considered singly. The haplotypes deriving from the pairwise combinations of the five studied SNPs were also statistically inferred. The most frequent haplotypes in controls were selected as references, and only the haplotype -1031C/-308G was significantly associated with AS (p=0.015) exerting in this disease a protective role (Odds Ratio: 0.43; Confidence Interval 95%: 0.22-0.85). Three SNPs were identified in TNFRSF1A gene and among them, only the R92Q (Minor Allele Frequency- MAF=0.034) and the c.625+10A>G (MAF=0.479) were selected for their potential functional implications. Both SNPs were not associated with the presence of SpA (χ2=1.073 and p=0.300 for R92Q; χ2=4.721 and p=0.094 for c.625+10A>G), but c.625+10A>G was associated with the response to anti-TNF therapy, assessed by BASDAI score lower /equal or higher than 4 at 10 months (p=0.031). Twenty-one SNPs were identified in MEFV gene and among them, 10 with a known potential functional significance. Variant alleles were extremely rare in our population (MAF<0.025) except for R202Q (MAF=0.27). None was associated with SpA diagnosis (p>0.05). Conclusions. In conclusion the results of this study indicate the relevant role of TNF-TNFR pathway genetics in the complex network causing SpA and conditioning response to therapy. TNFA was shown to be a predisposing factor for SpA, but mainly for AS, among Italian patients, while genetics of the autoinflammatory gene MEFV appears of no impact in this setting. The haplotype resulting from TNFA-1031C/-308G, potentially associated with lower TNF-α production, exerts a protective role in AS, while the TNFRSF1A c.625+10A>G polymorphism emerged as a potential predictor of response to anti- TNFα therapy.

Introduzione. Le spondiloartriti sieronegative (SpA) sono un gruppo di malattie infiammatorie croniche risultanti da una complessa interazione tra fattori genetici (tra cui, HLA-B27 è il maggior predisponente) e ambientali. Ed è tale interazione ad indurre l'attivazione di processi autoinfiammatori e la disregolazione del sistema immunitario caratterizzanti la malattia. In molti casi, una diagnosi precoce ed un adeguato monitoraggio dell’ attività di malattia risultano difficili a causa della sovrapposizione delle caratteristiche cliniche tra le diverse forme. Il ritardo nella diagnosi e conseguentemente nel trattamento, è inoltre dovuto al fatto che, gli indici d’infiammazione comunemente utilizzati nella pratica clinica, la velocità di eritrosedimentazione (VES) ed la proteina C-reattiva (PCR), sono nella norma in almeno metà dei pazienti con chiara espressione dell’attività di malattia. Il ritardo nella diagnosi conferisce a questi pazienti un carico sintomatico importante ed una perdita di funzione durante gli anni di vita produttiva. Pertanto, forte attenzione è attualmente rivolta all’identificazione di marcatori biochimici e genetici utili alla diagnosi e di fattori prognostici necessari a valutare l'efficacia del trattamento. Tra i fattori genetici predisponenti, è noto il ruolo di HLA-B27, che contribuisce però solo per il 20-30% all'ereditarietà totale, mentre il complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) rappresenta circa il 40-50% del rischio genetico di sviluppare la patologia. Questo dato ha suggerito il probabile coinvolgimento di altri geni nel meccanismo patogenetico. Studi di associazione genetica hanno permesso di identificare un certo numero di altri geni, associati alla patologia, sia nel locus MHC che in altri loci. In questo contesto, di grande interesse è lo studio della genetica di TNF-α, considerato il ruolo di tale citochina nel propagare e perdurare dell'infiammazione. Sebbene numerosi studi abbiano dimostrato l’associazione tra i polimorfismi di geni coinvolti nella via del segnale del TNF-α (es. TNFA, TNFSF15, TNFR1 e TRADD) e la patologia di SpA, i risultati sono discordanti. Di grande interesse sono anche le varianti del MEFV gene, coinvolto nella patogenesi della malattia autoinfiammatoria Febbre Mediterranea Familiare (FMF). Studi recenti hanno, infatti, dimostrato che le SpA, ed in particolare la spondilite anchilosante (AS), sono molto comuni tra i pazienti affetti da FMF e che questi pazienti possono presentarsi con AS come unica manifestazione. Questo studio, condotto su 91 pazienti e 223 controlli, provenienti da una regione italiana del Nord-Est, si propone di identificare fattori bioumorali (biochimici ed ematologici) e genetici al fine di supportare i processi diagnostici e prognostici (risposta alla terapia). In particolare, oltre ai parametri biochimici ed ematologici, è stato valutato se polimorfismi nella regione del promotore del gene TNFA, o dei geni TNFRSF1A e MEFV, possano concorrere con l’allele HLA-B27 all’aumento del rischio di sviluppare la malattia e/o nel predire la risposta agli inibitori del TNF-α. Metodi. La popolazione studiata comprendeva 91 pazienti con diagnosi di SpA (età media ± deviazione standard: 52.1 ± 12.5 anni; 57 maschi, 34 femmine) e 223 donatori di sangue (età media ± deviazione standard: 46 ± 11 anni; 146 maschi, 77 femmine) provenienti dalla Regione Veneto, una regione italiana del Nord-Est. Tra i pazienti, 36 presentavano AS e 55 artrite psoriasica (PsA), con diagnosi formulata sulla base dei criteri rispettivamente di New York e CASPAR. Il protocollo di questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale locale dell’Università-Azienda Ospedaliera di Padova, Italia (Prot.n. 3024P / 13), e tutti i soggetti arruolati hanno firmato un consenso informato prima di partecipare allo studio. Per ciascun soggetto arruolato, sono stati raccolti i dati demografici e fisiologici, la storia clinica e familiare. Sono stati raccolti poi, campioni di sangue, al fine di valutare l’emocromo e la VES, e di determinare i livelli di PCR, acido urico, prealbumina, alanina aminotransferasi (ALT) e glucosio. L’analisi molecolare dei geni MEFV (esoni 2,3,5 e 10) e TNFRSF1A (esoni 2,3,4 e 6) è avvenuta mediante sequenziamento diretto. La determinazione degli alleli HLA-B27 e dei polimorfismi del gene TNFA (-1031T>C;-857C>T;-376G>A;-308G>A;-238G>A) è stata condotta mediante PCR in Real-Time. La determinazione degli alleli HLA-CW6 è avvenuta mediante un test genetico molecolare CE-IVD, disponibile in commercio, che adotta la tecnologia microarray. L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando il software STATA (versione 13.1). Risultati. Un maggior numero di cellule polimorfonucleate circolanti e livelli di PCR più elevati sono stati rilevati nei pazienti affetti da SpA rispetto ai controlli. Inoltre, i pazienti affetti da PsA hanno mostrato livelli più elevati di ALT, non solo rispetto ai controlli, ma anche rispetto a pazienti affetti da AS. In ogni caso tali indici non erano molto elevati e spesso risultavano compresi entro gli intervalli di riferimento. Come atteso, gli alleli HLA-B27 sono risultati associati all’AS (χ2=120.1; p<0.0001). Sebbene una frequenza leggermente maggiore degli alleli HLA-CW6 sia stata osservata tra i pazienti con AS (circa il 6%) o PsA (circa il 13%) rispetto ai controlli (circa 4%), la differenza non è risultata essere statisticamente significativa. Nessuno dei polimorfismi del gene TNFA è risultato singolarmente associato alla diagnosi SpA, né a quella di AS o PsA, se valutate indipendentemente. Sono stati, poi, statisticamente dedotti gli aplotipi derivanti dalle coppie di combinazioni dei cinque polimorfismi studiati. Gli aplotipi più frequenti nei controlli sono stati selezionati come aplotipi di riferimento, e solo l’aplotipo -1031C/-308G è risultato significativamente associato con l’AS (p=0.015) esercitando in questa malattia un ruolo protettivo (odds ratio: 0.43; intervallo di confidenza al 95%: 0.22- 0.85). Tre polimorfismi sono stati identificati nel gene TNFRSF1A e tra questi, solo i polimorfismi R92Q (Frequenza dell’allele minore- MAF = 0.034) e c.625 + 10A> G (MAF = 0.479) sono stati selezionati a causa del potenziale ruolo funzionale. Entrambi i polimorfismi non sono risultati associati con la diagnosi di SpA (χ2 = 1.073 e p = 0.300 per R92Q; χ2 = 4.721 e p = 0.094 per c.625 + 10A> G). Il polimorfismo c.625 + 10A> G è però, risultato essere associato con la risposta alla terapia con anti-TNF, valutato sulla base di un punteggio BASDAI inferiore / uguale o superiore a 4, a 10 mesi dall’inizio della terapia (p = 0.031). Ventuno polimorfismi sono stati identificati nel gene MEFV e tra questi, 10 noti per il potenziale significato funzionale. Tali varianti alleliche sono risultate estremamente rare nella nostra popolazione (MAF <0.025) ad eccezione di R202Q (MAF = 0.27). Nessun polimorfismo è risultato essere associato con la diagnosi SpA (p> 0.05). Conclusioni. In conclusione, i risultati di questo studio suggeriscono il ruolo rilevante della genetica della via del segnale TNF-TNFR nel complesso sistema che induce la patogenesi di SpA e condiziona la risposta alla terapia. Il gene TNFA, nella popolazione oggetto di studio, si è dimostrato un fattore predisponente per lo sviluppo di SpA, ma soprattutto di AS. Al contrario, la genetica del gene MEFV non sembra mostrare alcun impatto in questo gruppo di malattie. L'aplotipo TNFA-1031C/-308G, potenzialmente associato alla produzione di livelli più bassi di TNF-α, sembra esercitare un ruolo protettivo nella patogenesi di AS, mentre è emerso che il polimorfismo c.625 TNFRSF1A + 10A> G costituisce un potenziale fattore predittivo di risposta alla terapia con anti-TNFα.