Molecular and morphological investigations on seaweed biodiversity and alien introductions in the Adriatic Sea (Mediterranean, Italy)

Biological diversity is important to the maintenance of healthy ecosystems and also represents an essential component of nations’ resources. The algae, macrophytes and phytoplankton, form the base of marine food webs, oxygenate aquatic environments, represent an underutilized resource for harvest and aquaculture, and can be used as biological indicator species. Unfortunately, algal biodiversity can be impacted upon negatively (overall reduction and/or shift in composition) by factors such as global warming, increased environmental stress arising from fisheries and aquaculture activities, and by accidental introductions of non-indigenous species (NIS). Most introductions of macroalgae into Europe during the last two centuries are related to human activities. Common vectors are shellfish transfers, ship traffic, with algae being carried as fouling organisms, or aquarium escapes. Being usually the sites of aquaculture activities, lagoon environments are particularly subject to these introductions, either accidental or voluntary, which comprises all possible negative effects from cell level to community level. In particular, in the Venice Lagoon, about 20 alien macroalgal species have been introduced since 1983 and more are reported by recent studies. Seaweeds are difficult to identify due to simply morphologies, phenotypic plasticity and convergent evolution. Molecular analyses are powerful tools for deriving phylogenies independent of the phenotypic characters on which traditional taxonomy is built. In spite of these considerations, most of the studies dealing with macroalgal biodiversity in Italian waters have been based only on morphological characters. For this reason the first aim of my project was to start molecular surveys on these organisms focusing on the Adriatic Sea (Mediterranean, Italy) and in particular on areas affected by intense shipping traffic and aquaculture activities. During the three years of this Ph.D. project we identified a series of new alien species using a molecular approach: the red algae Hypnea flexicaulius, Grateloupia turuturu, and Gracilaria vermiculophylla, and the green species Ulva pertusa, and Ulva californica. Most of them come from Japan with oysters, mussels and/or the Manila clam Ruditapes philippinarum Adams & Reeve. Two of the molecular marker used for these identifications were the plastid large subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (rbcL), very commonly employed in the taxonomy of algae, and the mitochondrial cox1 gene coding for the subunit I of cytochrome oxidase enzyme and proposed as a barcoding marker in red algae. Often these introduced entities present cryptic behaviors. To understand if a new reported alien taxon was the result of a recent introduction or was already present in the environment, but erroneously classified because of its cryptic morphology, we compared the sequences of our specimens with those, when available, obtained from old historical material. This is important, to summarize the occurrence and the distribution of introduced species. To amplify from old historical material, whose DNA could be partially damaged, we used two non coding regions whose small sizes make them appropriate for this purpose: the plastid rbcL-rbcS spacer region, proven to be a good marker for species discrimination being essentially invariant within a species, but extremely variable at the interspecific level and, the more variable mitochondrial cox2-cox3 spacer, useful for population studies. Some of the identified introduced species are opportunistic, highly competitive seaweeds with high rates of nutrient assimilation and propagule production. This can have negative impacts on the composition of the natural populations of macroalgae and seagrasses leading to environmental alterations and threatening the biodiversity of the Mediterranean Sea flora. This was the case of the species Gracilaria vermiculophylla, noticed by molecular analyses in the Po Delta lagoons (Adriatic Sea) in May 2008, and also found in the Venice Lagoon in March 2009 and along the coasts of the Emilia-Romagna Region in May 2009. Our data showed that this species has high growth rates forming abundant pleustophytic strains with biomasses up to 15 kg fwt m-2 that cover completely bottoms overcoming the growth of the local species, including laminar Ulvaceae. Besides the reports of single alien and potentially invasive species we studied the biodiversity of complex macroalgal genera focusing on those whose members are notoriously components of ships’ hulls and ballast waters and, for this reason, result commonly transported and widely introduced macroalgal species. We studied the green algal genus Ulva Linnaeus (Ulvaceae, Chlorophyta) a cosmopolitan taxon, which members show a very simple morphology and a certain degree of phenotypic plasticity, heavily influenced by environmental conditions, making difficult the delineation of species by morphological features alone. We have focused our attention on three sampling areas: Venice Lagoon, Chioggia inlet, and Lido of Venice. The first two are greatly affected by ship traffics, while the last one is much less influenced by this phenomenon. The molecular analyses, carried out using the rbcL gene and plastid elongation factor tufA (proposed as the best candidate for DNA barcoding among green algal species) as molecular markers, revealed the presence of six different species, often with overlapping morphologies: the alien species U. californica Wille, and U. pertusa Kjellman, beside the species U. flexuosa Wulfen, U. rigida C. Agardh, U. compressa Linnaeus, and one probable new taxon. Another genus investigated during this project was the genus Ceramium (Ceramiaceae, Rhodophyta), a large and systematically complex group due to the high degree of morphological variation. Culture studies, suggesting a strong influence of environment on phenotype, and the use of molecular tools have recently questioned the validity of morphological features used in species recognition. We compared three Ceramium taxa from Venice lagoon with samples from northwest Europe using the rbcL gene and the rbcL-rbcS intergenic spacer combined with morphological observations in order to better define the taxonomic position of the Italian species and to make a revision of the taxa really present in this area. During these surveys on DNA diversity, we discovered specimens that may be flagged as potential new species. Often these findings are not due to extra-Mediterranean introductions but to misidentifications with other species still present in the studied area, that are characterized by a cryptic behaviour. We characterized a new Gracilaria species from the Venice Lagoon, identified using the plastid rbcL gene and the intergenic rbcL-rbcS spacer, combined with morphological observations and pigment composition. This new entity, recorded in the artificial substrata of the Venice Gulf and never found in other localities of the Adriatic Sea, was not described by local or international literature up to now, and adds to the other 11 Gracilaria taxa recorded in the Mediterranean Sea. Probably the recent finding of this new species is the consequence of its misidentification with other specimens whose morphologies are very similar: Gracilaria gracilis and Gracilaria conferta. All these studies underline the difficulty in morphological identification of macroalgal species and highlight the current systematic problems: the misidentification of cryptic species, the number of superfluous and synonymised species names recorded and the use of distinct names for a same species sampled from different regions. Moreover the presence of several morphotypes belonging to the same taxon can lead to other possible errors: assignment of different morphotypes to distinct species or misidentification of species actually different. These features are great hindrance for the development of a more universal, rather than more restrictive, taxonomy of algae. Systematic studies to solve this kind of problems can involve comparison with type specimens (on which species names are based), typically stored in collections or described in the scientific literature. With the spread of the DNA barcoding method, molecular techniques have developed to extract DNA and to amplify molecular markers also from historical material, making herbaria a precious source of information. During my PH.D. project we started a systematic study on the type species of the genus Gracilaria, a taxonomically challenging group because of structural simplicity, high morphological plasticity, and great species diversity. Classically, the identification of Gracilaria species has been based on gross morphological characters and incorrect applications have often led to misidentifications. In this study we analyzed some Mediterranean entities, both preserved in herbarium collection of the University of Padova (Italy) and recently sampled, which morphology was very different and put their belonging to the type species G. bursa-pastoris in doubt. The comparison of the rbcL-rbcS sequences of the different samples considered in this study and that obtained from the lectotype (Sphaerococcus compressus Cabrera; herb. alg. Agardh, LD 28984) revealed that the specimens collected in Venice and in Taranto, easily attributable to different species, are actually an example of different morphotypes of the same species, G. bursa-pastoris. On the other hand, one herbarium specimen, collected in 1869, at the time misidentified with G. compressa (now G. bursa-pastoris) on the basis of morphological features, represents, instead, a putative new species never sequenced before. This project represents the first study on seaweed biodiversity in the Adriatic Sea based on molecular data. The results obtained in this work reveal that DNA barcoding, removing the reliance on morphological features, represents a valid approach to discriminate species and for this reason it is a good way to have an objective survey of the entities present in the different regions.

La biodiversità è fondamentale per la conservazione degli ecosistemi e rappresenta una componente essenziale delle risorse di una nazione. Le alghe sono alla base delle catena alimentare degli ambienti marini, hanno una valenza economica, soprattutto per quanto riguarda le attività di acquacoltura e possono essere usate come specie indicatrici per valutare eventuali impatti ambientali. Sfortunatamente la biodiversità di questi organismi è attualmente minacciata da fattori quali, il riscaldamento globale, l’aumento dello stress dovuto alle attività di pesca e acquacoltura, oltre che all’introduzione di specie aliene potenzialmente invasive. Ogni anno, in Europa, l’incremento dei traffici navali con paesi extra-Mediterranei, sia per l’importazione di prodotti ittici, che per le attività di acquacoltura porta all’introduzione di nuove specie, di cui la maggior parte macroalghe. Gli ambienti lagunari sono particolarmente soggetti a questo fenomeno essendo, solitamente, i siti predisposti per gli impianti di allevamento di molluschi di importazione. Ad esempio, per quanto riguarda la laguna di Venezia, 20 macroalghe aliene sono state riportate a partire dal 1983 e altre vengono segnalate ogni anno da recenti studi. Per quanto riguarda il gruppo delle macroalghe, la discriminazione tra specie è resa particolarmente difficile se basata solo sulle caratteristiche morfologiche sia per l’elevato tasso di variazioni a livello dell’habitus del tallo legato ai diversi parametri ambientali di crescita, che per la presenza di specie criptiche e per lo stile di vita epifita di molte di esse. Negli ultimi anni gli studi effettuati su questi organismi si sono sempre più incentrati sull’uso del DNA barcoding come un metodo veloce e affidabile per l’identificazione delle diverse specie sia autoctone che alloctone. Purtroppo, per quanto riguarda le coste italiane, la maggior parte degli studi effettuati in questo campo sono ancora basati unicamente su caratteri morfologici. Per questo motivo, lo scopo principale del mio progetto di dottorato è stato quello di iniziare un indagine di tipo molecolare sulla biodiversità e distribuzione di questi organismi focalizzandomi sul mar Adriatico (Mediterraneo, Italia) e in particolare su siti affetti da intensi traffici navali e attività di acquacoltura. Attraverso questo tipo di approccio durante i tre anni di questa ricerca sono state identificate una serie di nuove specie di macroalghe alloctone: Hypnea flexicaulis, Grateloupia turuturu e Gracilaria vermiculophylla appartenenti al gruppo delle Rhodophyta e Ulva pertusa e Ulva californica facenti parte del phylum Chlorophyta. Si tratta soprattutto di specie provenienti dal Giappone dove spesso vengono coltivate in quantità massive per scopi alimentari o industriali. Due dei marker molecolari usati a questo scopo sono stati il gene plastidiale rbcL, codificante per la subunità grande dell’enzima Rubisco, e comunemente utilizzato per lo studio delle macroalghe, assieme al gene mitocondriale cox1, codificante per la subunità I dell’enzima citocromo ossidasi e proposto come miglior candidato nell’ambito del DNA barcoding delle Rhodophyta. Poiché spesso le specie alloctone possono presentare un aspetto morfologico molto simile a quello delle specie autoctone (specie criptiche), sono state effettuate delle comparazioni tra le sequenze dei nuovi campioni con quelle ottenute da campioni conservati in erbari storici. Questo al fine di capire se la specie riportata come nuova introduzione non fosse già precedentemente presente nei nostri mari e erroneamente classificata in base alla sua natura criptica. Ciò è importante per ricostruire la dinamica temporale delle introduzioni degli organismi rinvenuti oltre a dare indicazioni su quali siano le possibili popolazioni di origine dei nostri campioni e poter quindi identificare il luogo di provenienza delle varie specie. Per l’amplificazione da materiale storico, il cui DNA potrebbe essere parzialmente deteriorato, sono stati usati come marker degli spaziatori intergenici, che per la loro lunghezza di poche centinaia di basi si prestano efficacemente a questo scopo. In particolare sono stati utilizzati lo spaziatore plastidiale rbcL-rbcS, che risulta essere un buon marker per la discriminazione a livello inter specifico e il più variabile spaziatore mitocondriale cox2-cox3 utile negli studi a livello di popolazione. Molte delle specie alloctone sono caratterizzate da elevati tassi di crescita e dalla capacità di vivere anche in ambienti particolarmente eutrofizzati ed inquinati. Questo spesso causa un rapido rimpiazzo delle popolazioni autoctone di macroalche e fanerogame marine che occupano la stessa nicchia ecologica creando profonde alterazioni ambientali. Le specie alloctone, infatti, a seconda del grado di invasività, possono rappresentare una grave minaccia per la biodiversità della flora del Mediterraneo se non vengono messe in atto appropriate precauzioni. Questo è stato il caso di una specie di alga rossa, Gracilaria vermiculophylla, identificata tramite tecniche molecolari nell’area del delta del Po (Maggio 2008), e rinvenuta durante i campionamenti di questo progetto anche nelle aree della Laguna di Venezia e lungo le coste dell’Emilia-Romagna (Marzo-Maggio 2009). I nostri dati hanno riportato che questa Rhodophyta si è largamente diffusa nelle aree dell’alto Adriatico con biomasse che superano i 15 kg di peso fresco per m2. Questo ha portato a un parziale rimpiazzo di alcune specie autoctone tra cui anche alcune Ulvaceae. Oltre all’identificazione di singole specie aliene e di potenziali specie invasive, durante questo progetto, sono stati esaminati anche generi macroalgali particolarmente complessi dal punto di vista tassonomico, i cui membri sono spesso componenti dell’hull fouling e delle ballast waters delle navi e per questo motivo risultano specie macroalgali comunemente trasportate e potenzialmente introdotte in ambienti diversi dal loro areale di origine. In particolare ci siamo soffermati sui generi Ulva (Ulvaceae, Chlorophyta) e Ceramium (Ceramiaceae, Rhodophyta), entrambi taxa cosmopoliti con specie di difficile identificazione a causa dell’elevata variabilità morfologica altamente influenzata dai fattori ambientali. Sono stati scelti tre siti di campionamento: la laguna di Venezia, il litorale di Chioggia e il Lido di Venezia. I primi due affetti da intensi traffici navali e da un elevata eutrofizzazione delle acque, il terzo meno soggetto a questi fenomeni. Per quanto riguarda il genere Ulva, le analisi molecolari condotte utilizzando il gene plastidiale rbcL e il fattore di elongazione tufA (proposto come buon marker per il DNA barcoding delle alghe verdi), ha rilevato la presenza di sei diversi taxa di cui due specie aliene U. californica e U. pertusa oltre a una terza probabile nuova specie. Nel caso del genere Ceramium, la cui sistematica è oggigiorno ancora in uno stato di caos, le sequenze ottenute dall’amplificazione del gene rbcL e dello spaziatore intergenico rbcL-rbcS, dei tre gruppi morfologici identificati, sono state comparate con quelle di specie provenienti dal Nord Atlantico. Questo, assieme a un attento esame morfologico, ha permesso una corretta collocazione tassonomica dei campioni Adriatici e una revisione delle specie finora segnalate per quest’area. Inoltre, le analisi molecolari di alcuni campioni di dubbia identità ha rilevato la presenza di possibili nuove specie. Spesso questi ritrovamenti non sono dovuti a introduzioni da aree extra-Mediterranee ma possono essere causate dalla natura criptica di questi taxa, che li rende facilmente confondibili dal punto di vista morfologico, con altre specie già descritte per l’area di studio. E’ questo il caso di una nuova specie di Gracilaria rinvenuta in Laguna di Venezia che è stata identificata tramite il gene rbcL e lo spaziatore rbcL-rbcS e di cui è stata effettuata una caratterizzazione completa sia dal punto di vista della morfologia che da quello della composizione in pigmenti. Questa nuova entità va ad aggiungersi alle altre 11 specie di Gracilaria riportate per il Mar Mediterraneo. Tutti gli studi effettuati durante questo progetto sottolineano la difficoltà di identificazione degli organismi macroalgali e i problemi tassonomici correlati a questo e tuttora irrisolti. Un esempio è la moltitudine di nomi e/o sinonimi registrati per la stessa specie spesso usati per identificare campioni provenienti da diverse aree del mondo a seconda delle diverse chiavi dicotomiche utilizzate o a causa della presenza di diversi morfotipi. A tutt’oggi questo rappresenta un ostacolo per lo sviluppo di una tassonomia universale e più oggettiva dei gruppi macroalgali. Gli studi sistematici atti a risolvere questo tipo di problemi spesso si basano sulla comparazione con campioni tipo delle varie specie conservati in collezioni storiche. Dato lo sviluppo delle tecniche molecolari anche per quanto riguarda il materiale storico, gli erbari sono diventati una preziosa fonte di informazione per i tassonomi moderni. Durante il mio dottorato ho iniziato uno studio molecolare sulla specie tipo del genere Gracilaria (G. bursa-pastoris) caratterizzata da un ampia variabilità fenotipica. Infatti i campioni freschi raccolti nelle aree di Venezia e Taranto presentavano morfologie dei talli molto diverse, tali da mettere in dubbio la loro appartenenza alla specie G. bursa-pastoris. Per questo motivo sono stati presi in esame anche campioni storici (erbario A. Forti 1927 conservato all’Orto Botanico dell’Università di Padova) oltre che il lectotipo del genere ottenuto dalla collezione storica di Agardh del Museo Botanico dell’Università di Lund (Svezia). La comparazione con il materiale storico e soprattutto con il campione tipo ha rilevato che si trattava di morfotipi attribuibili tutti effettivamente a G. bursa-pastoris, tranne che per un campione di algario (Savona, 1869) che era stato al tempo erroneamente classificato su base morfologica e che rappresenta invece una nuova specie mai sequenziata finora. Questo progetto di Dottorato rappresenta il primo studio sulla biodiversità macroalgale del mar Adriatico basato su un approccio molecolare. I risultati ottenuti hanno rivelato che il DNA barcoding rappresenta un metodo efficace per la discriminazione delle specie e permette di ottenere, così, una visione oggettiva delle entità presenti nelle diverse aree di studio.