The Double Face of Nucleic Acids

Nucleic acids have been the object of intense and thorough observations for more than a century, leading to the understanding of their structure and function. Their role as genetic information carriers is well established but there are evidences that they are also involved in a series of other less known processes. RNA for example is a single strand biopolymer that, dependently from the primary sequence, can assume complex three-dimensional foldings that allow binding to diverse target molecules or the involvement in catalysis. Being closely related to several cellular events, they are also useful therapeutic targets. This work is essentially divided in two parts, aimed at studying two different and complementary aspects of nucleic acids. While the first project goes into the understanding of the “RNA world” and of the applicability of extraordinary RNA conformational variability in a diagnostic and therapeutic system, the second topic is addressed to study the ability of two compounds to interfere with DNA integration, a genetic process that allows the viral DNA to be inserted into the host genome. Therefore nucleic acids demonstrate their “double face” meaning their ability to be leading actors in diagnosis and therapy but also indispensable supporting actors, being the main targets for several drugs. The first part of the PhD program was focused on the use of SELEX to discover a new diagnostic or therapeutic tool. A protocol for the selection of RNA aptamers binding folic acid was developed. In particular, after 12 cycles of SELEX using affinity chromatography, it was possible to select an enriched pool of single stranded RNA oligonucleotides with affinity for the target. Subcloning and sequencing of the above-mentioned pool allowed the subsequent analysis of the oligonucleotide three-dimensional structure and the determination of the minimum binding sequence to folic acid. Computer tools and RNase protection assay were associated in the experimental protocol to obtain the most probable outcome. A clear region of ligand interaction on RNA was identified; this minimum sequence was chemically synthesized and Isothermal Titration Calorimetry (ITC) used for the determination of the binding constant of folic acid, that resulted in the nanomolar range. The approval from FDA and EMEA of Macugen®, a pegylated aptamer selective for the binding to VEGF and used in the treatment of age-related macular degeneration, is a proof that SELEX can be used to develop good drugs and diagnostics. RNA aptamers against folic acid could now find their way for diagnostic or therapeutic application. Therefore further studies must be addressed to allow their applicability to the desired purpose. The second part of the PhD program was carried out in the Laboratory of Molecular Pharmacology of the National Cancer Institute (National Institute of Health - Bethesda -Maryland - USA) and it takes into consideration DNA integration as target of anti-HIV drugs. HIV-1 integrase is one of the viral enzymes encoded from the POL gene, that catalyses the insertion of the viral DNA into host chromosomes. Using synthetic oligonucleotides mimicking the terminal portion of the U5 viral LTR, it was analyzed the effect of two important drugs (raltegravir, the first integrase inhibitor approved by FDA last year, and elvitegravir, in advanced stage of human clinical trials) on the recombinant wild type integrase and on a series of resistant mutants. The study was addressed to compare raltegravir and elvitegravir on the same in vitro system, with the aim to understand how different aminoacidic point mutations of the protein sequence are responsible in the onset of drug resistance.

Dal giorno della loro scoperta più di un secolo fa, gli acidi nucleici sono stati analizzati e studiati approfonditamente in tutti gli aspetti, cercando di svelare gli ancora numerosi segreti nascosti nella loro struttura per comprenderne appieno le funzioni. Il ruolo più assodato ed essi associato è sicuramente quello di trasportatori dell’informazione genetica ma numerose evidenze sperimentali confermano il coinvolgimento in una serie di altri processi meno noti. Basta pensare a come l’RNA, grazie alle complesse conformazioni tridimensionali che può assumere dipendentemente dalla sua sequenza primaria, risulti coinvolto nel legame a svariate molecole e risulti ancor più straordinariamente responsabile di processi catalitici. Essendo quindi correlati a numerosi eventi cellulari, gli acidi nucleici sono utili bersagli terapeutici. Il presente lavoro è suddiviso essenzialmente in due parti ed è finalizzato alla comprensione di due aspetti differenti ma complementari legati agli acidi nucleici. Il primo progetto infatti si pone l’obiettivo di conoscere il vasto “mondo dell’RNA” e di applicare la straordinaria variabilità conformazionale di questo biopolimero ad un sistema terapeutico o diagnostico. La seconda parte della ricerca è invece indirizzata all’analisi dell’effetto di composti sul processo di integrazione del DNA, un meccanismo genetico che permette al DNA virale di essere correttamente inserito nel genoma dell’ospite. Gli acidi nucleici dimostrano quindi la loro “doppia faccia” intesa come la loro capacità di essere i protagonisti in sistemi di diagnosi o di terapia ma anche indispensabili attori co-protagonisti, essendo essi stessi i bersagli principali di numerosi farmaci. La prima metà del ciclo di dottorato di ricerca si è concentrata sull’uso della tecnologia SELEX. Inizialmente si è sviluppato un protocollo per la selezione di aptameri contro l’acido folico. Un totale di 12 cicli di SELEX mediante cromatografia d’affinità, hanno condotto alla selezione di un pool di molecole di RNA a singolo filamento, aventi un’elevata predisposizione a legare il target d’interesse. Il subclonaggio e il sequenziamento del suddetto insieme di molecole ha poi permesso di approfondire l’analisi delle caratteristiche tridimensionali degli oligonucleotidi e della minima sequenza responsabile del legame all’acido folico. A questo scopo, è stata condotta un’analisi informatizzata elementare ed è stato sviluppato un protocollo per l’RNase protection assay. L’associazione dei risultati ottenuti con le due diverse metodiche ha permesso di definire una chiara regione di interazione tra RNA e ligando. Questa minima sequenza è stata quindi sintetizzata chimicamente e sottoposta, mediante Isothermal Titration Calorimetry (ITC), alla determinazione della costante di legame, che è risultata essere nell’intervallo nanomolare. L’approvazione da parte di EMEA e FDA di Macugen®, un aptamero peghilato selettivo per il legame a VEGF e usato nel trattamento della degenerazione maculare senile, è una prova di come la SELEX possa essere un utile strumento per lo sviluppo di farmaci e diagnostici. Gli aptameri ad RNA contro l’acido folico selezionati nel presente lavoro possono ora seguire la via dello sviluppo per l’applicazione desiderata e ulteriori studi saranno condotti a questo scopo. La seconda metà del ciclo di dottorato di ricerca è stata invece svolta nel Laboratorio di Farmacologia Molecolare del National Cancer Institute (National Institute of Health - Bethesda - Maryland - USA) e ha preso in considerazione il processo di integrazione del DNA come bersaglio di farmaci anti-HIV. L’integrasi dell’HIV-1 è un enzima virale codificato dal gene POL e catalizza l’inserzione del DNA virale nei cromosomi della cellula ospite. Oligonucleotidi sintetici, con sequenza corrispondente alla porzione U5 terminale della LTR virale, sono stati utilizzati allo scopo di analizzare l’effetto di due importanti farmaci (raltegravir, il primo farmaco inibitore dell’integrasi approvato dall’FDA lo scorso anno, e elvitegravir, un composto in stadio avanzato di ricerca clinica) sull’enzima nativo ricombinante e su una serie di mutanti resistenti ai farmaci in questione. Lo studio è stato essenzialmente indirizzato a confrontare raltegravir e elvitegravir sullo stesso sistema in vitro, cercando di capire come differenti mutazioni aminoacidiche della proteina siano responsabili dell’insorgenza di resistenza al trattamento.