Sviluppo di un sistema dell' espressione inducibile per l' espressione condizionale in micobatterio basato sull' utilizzo dei repressori Pip e TetR

Inducible gene expression systems are powerful tools for studying gene function and for the validation of drug targets in bacteria. We report the development of a novel gene regulation system that allows negative-controlled gene expression. The system is based on two repressors: Pip and TetR. The gene of interest is placed under the transcriptional control of a Pip-dependant promoter (ptr); the Pip encoding gene, however, is placed under TetR transcriptional regulation. Both pip and tetR were integrated into the chromosome using an integrative plasmid. In the absence of ATc, TetR represses pip and the gene of interest can be transcribed. However, upon addiction of anhydrotetracycline (ATc), TetR allows pip expression, resulting in the stringent repression of the gene of interest. Using lacZ as a reporter gene, we showed that supplementation with subinhibitory concentrations of ATc allows stringent repression of its transcription in M. smegmatis and M. tuberculosis both in liquid and in solid media. Time-course and dose-response experiments showed that repression could be modulated in response to ATc concentration. One of the most useful applications of a reverse-inducible system is the possibility to construct conditional mutants of essential genes, allowing their characterization and validation as drug targets. At this purpose we constructed a M. smegmatis mutant where the ftsZ promoter was replaced with a Pip regulated promoter. Upon integration of the integrative plasmid carrying pip and tetR, the recombinant strain was unable to growth in sub- inhibitory ATc concentration, confirming ftsZ repression. The same technique was used in M. tuberculosis where fadD32 operon (essential in M. tuberculosis) and rv3213c (not essential in M. tuberculosis) were placed under Pptr transcriptional control. In the presence of ATc (in the concentration of 200ng/ml) only the conditional mutant of rv3213c was able to grow demonstrating that fadD32 operon is essential in M. tuberculosis. A different strategy to construct conditional mutant of Rv3790 was elaborated; this gene belongs to a large operon in M. tuberculosis so it was elaborated a technique that allows to have an dependant ATc- regulation only in Rv3790 while the other genes continue to be transcribed by their wild- type promoter. The development of a novel reverse-inducible system based on ATc will represent an invaluable tool to study essential genes and virulence-associated genes in mycobacteria.

I sistemi d'espressione inducibili rappresentano ad oggi un potente mezzo con il quale studiare la funzione dei geni essenziali e nell'individuazione di bersagli farmacologici. Essi infatti si dimostrano fondamentali nello studio della funzione di geni quando questa è sconosciuta in quanto permettono di dosarne l'attività in risposta ad un semplice stimolo come l'aggiunta al terreno di un metabolita. Questo sarà un importante strumento per facilitare sia lo studio di nuovi regolatori che lo studio di geni essenziali o importanti per la virulenza. Durante questo triennio di dottorato la mia attività di ricerca si è occupata dello sviluppo e della caratterizzazione di un sistema di regolazione genica per micobatterio che permettesse un controllo negativo basato sull'attività di due repressori: Pip e TetR. In questo sistema il gene d'interesse è posto sotto il controllo trascrizionale di un promotore dipendente da Pip (ptr); Pip a sua volta è posto sotto la regolazione di TetR attraverso l'inserimento nel suo promotore, di due operatori (tetO) riconosciuti specificamente da TetR. L'induttore utilizzato per questo sistema è l'antibiotico anidrotetraciclina (ATc), prodotto di degradazione della tetraciclina, meno tossico ma ancora in grado di interagire con il regolatore TetR. In assenza di ATc, TetR reprime pip e il gene d'interesse puಠessere trascritto; con l'aggiunta di ATc invece si ottiene come effetto l'espressione di pip e di conseguenza lo spegnimento trascrizionale del gene di interesse. Un'applicazione molto utile per un sistema d'espressione inducibile è la costruzione di mutanti condizionali per lo studio di geni essenziali con lo scopo di valutare la possibilità di validare il loro impiego come bersagli farmacologici. A tal fine è stato costruito un mutante condizionale in M. smegmatis, dove il promotore del gene ftsZ, è stato sostituito dal promotore regolato dal repressore pip. Tale mutante in seguito, è stato trasformato con il plasmide integrativo avente entrambi i repressori ed il ricombinante ottenuto è risultato incapace di crescere già a concentrazioni sub-inibitorie di ATc, confermando cosଠla repressione trascrizionale di ftsZ. Lo stesso metodo è stato impiegato per ottenere due mutanti condizionali in M. tuberculosis H37Rv dove l'operone di fadD32 (essenziale in M. smegmatis), o il gene rv3213c (non essenziale; utilizzato come controllo) sono stati posti sotto il controllo trascrizionale di Pptr. In presenza di ATc (in concentrazione pari a 200ng/ml) solo il mutante condizionale di rv3213c è stato in grado di crescere dimostrando come l'operone di fadD32 sia essenziale anche in M. tuberculosis. Una tecnica alternativa per l'ottenimento di un mutante condizionale è stata applicata con il gene Rv3790 di M. tuberculosis; poiché esso appartiene ad un operone costituito da 12 geni, non è stato possibile utilizzare la strategia prevista per ftsZ e fadD32 in quanto un silenziamento di Rv3790 si sarebbe trasmesso anche all'intero operone. Per poter analizzare gli effetti dovuti unicamente alla presenza/ assenza di Rv3790 nella cellula batterica, è stato sviluppato un sistema dove la regolazione ATc- dipendente è stata vincolata solamente al gene suddetto mentre i geni appartenenti al medesimo operone continuavano ad essere regolati a livello trascrizionale dal loro promotore wild- type. Lo sviluppo di un innovativo sistema d'espressione inducibile che utilizza l'anidro- tetraciclina come induttore, rappresenta uno strumento prezioso per lo studio di geni che sono essenziali ed associati alla virulenza nel micobatterio.