The role of Calcium/calmodulin-dependent kinase and Calcineurin pathways in activity-dependent gene regulation in skeletal muscle

Motor neuron activity is a fundamental controller of skeletal muscle growth and differentiation. Excitation-transcription coupling is the process whereby activity causes specific changes in gene transcription through an increase in the concentration of sarcolemmal calcium (Ca2+). The molecular mechanisms that relay plasma membrane depolarization to activity-dependent gene transcription is not yet fully understood. Two main Ca2+-dependent pathways are known to transduce Ca2+ signals into changes in gene expression, the Cn-NFAT and CaMK pathways. We have focused on Cn-NFAT and CaMKII, which is the major CaMK isoform in skeletal muscle. We have studied the effects of the inhibition of these pathways on the expression of Ca2+-dependent genes involved in muscle metabolism, such as glucose transporter 4 (GLUT4), mitochondrial transcription factor A (TFAM) and citrate synthase (CS), or in muscle contraction and specific of slow or fast IIB fibers, such as myosin heavy chain-slow and -2B (MyHC-slow and -2B). To this purpose we have used a loss-of-function approach by co-transfecting vectors, coding for natural peptide inhibitors of Cn and CaMKII pathways, together with Luciferase (LUC) reporters in rat skeletal muscle, through in vivo electroporation. We have analyzed the effects of these inhibitors on activity-dependent gene expression. Our results indicate that CaMKII controls not only muscle metabolism, by regulating the expression of GLUT4, TFAM and CS, but also the expression of contractile proteins, such as MyHC-slow and -2B. The Cn-NFAT signalling pathway has been widely demonstrated to be a fundamental regulator of muscle fiber slow program. Interestingly our data indicate that Cn also controls the expression of genes involved in muscle metabolism such as GLUT4 and CS. A question remains open as to whether CaMKII and Cn pathways can synergistically control the expression of shared activity-dependent genes. If synergy exists it will be interesting to investigate which is the molecular target underlying CaMKII and Cn synergistic cooperation.

L’attivita’ dei motoneuroni ha un ruolo fondamentale nella crescita e nel differenziamento del muscolo scheletrico. Il cosiddetto processo di accoppiamento eccitazione-trascrizione, attraverso l’aumento del livello di calcio (Ca2+) nel sarcolemma, causa specifici mbiamenti attivita’-dipendenti nella trascrizione genica. I meccanismi molecolari che convertono la depolarizzazione della membrana plasmatica in specifiche variazioni nella trascrizione genica-attività dipendente, non sono ancora del tutto chiari. Nel muscolo scheletrico, sono note due principali vie Ca2+/calmodulina-dipendenti che accoppiano i segnali del Ca2+ a cambiamenti dell’espressione genica: esse sono le vie calcineurina (Cn)-NFAT e chinasi Ca2+/calmodulina-dipendenti (CaMK). In questo lavoro abbiamo incentrato la nostra attenzione sulla via Cn-NFAT e su CaMKII, la principale isoforma di CaMK nel muscolo scheletrico. Abbiamo studiato gli effetti dell’inibizione di queste vie sull’espressione di alcuni geni Ca2+-dipendenti implicati nel metabolismo muscolare, come il trasportatore del glucosio 4 (GLUT4), il fattore di trascrizione mitocondriale A (TFAM) e la citrato sintasi (CS), e nella contrazione muscolare e specifici per le fibre slow o rapide 2B, come il gene della catena pesante della miosina-lenta e -2B (MyHC-slow e -2B). A tale scopo, abbiamo utilizzato un approccio loss-of-function, co-trasfettando vettori, codificanti inibitori endogeni delle vie Cn e CaMKII, insieme a sensori luciferasi (LUC), mediante elettroporazione in vivo. Abbiamo analizzato gli effetti di tali inibitori sull’espressione di geni attività-dipendenti. I nostri risultati indicano che l’attività di CaMKII controlla non solo il metabolismo muscolare, regolando l’espressione di GLUT4, TFAM e CS, ma inaspettatamente abbiamo dimostrato che ha un effetto anche sull’espressione di proteine contrattili quali MyHC-slow e -2B. E’ stato largamente dimostrato che la via di segnale Cn-NFAT ha un ruolo fondamentale nella regolazione del programma lento della fibra muscolare. I nostri dati suggeriscono che Cn controlla anche l’espressione di geni metabolici, come per esempio GLUT4 e CS. Stiamo cercando di chiarire se le vie CaMKII e Cn possono controllare sinergicamente l’espressione di geni bersaglio condivisi. Nel caso in cui si verifichi tale sinergia, cercheremo di caratterizzare il meccanismo molecolare alla base di tale sinergia.