Different behaviour of liver and brain mitochondria in Permeability Transition: role of biogenic monoamines

Biologically active amines are a class of compounds synthesized by normal metabolic processes in living organisms. They are classified as biogenic amines (serotonin, agmatine, tyramine, histamine, dopamine, phenylethylamine, tryptamine and catecholamines), or polyamines (putrescine, spermidine and spermine). Biogenic amines can act as neurotransmitters and display various other physiological functions throughout the organism. The degradation of these molecules is catalyzed by monoamine oxidases (MAOs) A and B, isoenzymes localized on outer mitochondrial membrane, which induce an oxidative deamination. This reaction leads to the production of hydrogen peroxide and aldehydes, which are then oxidized into acids or converted into alcohols or glycols. In particular hydrogen peroxide can trigger the formation of other reactive oxygen species (ROS) and induce mitochondrial damages and apoptosis. Considering that biogenic amines can undergo these catabolic reactions, the possible effects of them, or of their products, on different types of mitochondria, were studied. The aim of this work was to study the action of monoamines as regulator of mitochondrial functions in isolated rat mitochondria from different organs: liver, brain, heart, and kidney. The first part of the work focused on the action of these amines on mitochondrial permeability transition induction. They induce a collapse of  and a strong amplification of swelling in rat isolated mitochondria of liver (RLM), heart (RHM) and kidney (RKM). Furthermore they oxidize thiol groups and pyridine nucleotides. These observations support the hypothesis that monoamines are amplifiers of mitochondrial permeability transition (MPT), inducing an oxidative stress, through the generation of H2O2, which is most probably the agent responsible of MPT occurrence. Instead, in isolated rat brain mitochondria (RBM), the amines do not amplify the swelling and do not alter the partial drop of  induced by Ca2+, even if they oxidize thiol groups and pyridine nucleotides. These results led us to hypothesize the existence in RBM of a mechanism of MPT pore opening different from that present in the other mitochondria. In the second part of the study it is reported the serotonin uptake by mitochondria with characterization of the transport system. Experimental evidences suggesting that aldehyde is the possible accumulated species are reported. Finally, in the third part of the work, in order to better define the process that triggers MPT in RBM we have investigated the role of signaling pathways, in particular the possible involvement of P-Tyr-phosphorilated proteins since it has been reported that this type of mitochondria contains Tyr-kinases of the Src-family. We found, on the one hand, that a variety of tyrosine-kinase inhibitors do not affect the process while the “Inhibitor Tyr-phosphatases Cocktail 2”, and the known phosphatase inhibitor sodium-pervanadate reduce the occurrence of MPT in parallel with an increase of the P-Tyr level of some proteins, in particular of proteins of apparent M.W. of 160, 72 and 35 kDa. Experiments are in progress to define, first of all, the identity of the P-Tyr-Protein involved in this process and then the characteristics and physiological significance of this phenomenon. In conclusion the obtained results show an important role of monoamines in mitochondria that depends on the tissues and their specific physiological processes. Furthermore two different mechanisms seem to be involved in MPT. In RLM the opening of permeability transition pore appears to require oxidation of thiol groups and the MPT amplification seems to depend on the oxidative stress induced by the reactive oxygen species produced by monoamine oxidation. In RBM the pore opening seems to involve two different mechanisms: in addition to the oxidative stress also the Tyr-phosphorylation of some proteins whose nature is under investigation.

Le amine biologicamente attive sono una classe di composti sintetizzati negli organismi viventi da normali processi metabolici. Esse sono classificate come amine biogene: serotonina, agmatina, tiramina, istamina, dopamina, feniletilamina, triptamina e catecolamine, o poliamine : putrescina, spermidina e spermina. Le amine biogene possono agire come neurotrasmettitori e dimostrano altre funzioni fisiologiche in diversi organi. La degradazione di queste molecole è catalizzata dalle monoamino-ossidasi (MAO) A e B, isoenzimi localizzati sulla membrana esterna mitocondriale, che inducono una deaminazione ossidativa. Questa reazione porta alla produzione di perossido di idrogeno e delle corrispondenti aldeidi, che vengono poi ossidate ad acidi o ridotte ad alcoli o glicoli. In particolare, il perossido di idrogeno può innescare la formazione di altre specie reattive dell'ossigeno (ROS) e indurre danni mitocondriali e apoptosi. Considerando che le amine biogene possono subire queste reazioni cataboliche, i loro possibili effetti, o quelli dei loro prodotti di ossidazione, sono stati studiati sui diversi tipi di mitocondri. Lo scopo di questo studio è stato quello di studiare l'azione delle monoamine come regolatrici delle funzioni mitocondriali nei mitocondri isolati da differenti organi di ratto: fegato, cervello, cuore e reni. La prima parte del lavoro si concentra su l'azione di queste ammine sull'induzione di transizione di permeabilità mitocondriale. Esse producono un crollo del potenziale elettrico di membrana (ΔΨ) e una forte amplificazione dello swelling di mitocondri isolati di fegato (RLM), cuore (RHM) e reni (RKM) di ratto. Inoltre le amine ossidano i gruppi tiolici e i nucleotidi piridinici. Queste osservazioni supportano l'ipotesi che le monoamine siano amplificatrici della transizione di permeabilità mitocondriale (MPT), inducendo uno stress ossidativo, attraverso la generazione di H2O2. Quest’ultimo composto sembra essere, molto probabilmente, l'agente responsabile dell’induzione della MPT. Invece, nei mitocondri di cervello di ratto (RBM), le amine non amplificano lo swelling e non alterano il parziale calo di ΔΨ indotti dal Ca2+, nonostante i gruppi tiolici e i piridin nucleotidi vengano ossidati come nei RLM. Questi risultati ci hanno portato ad ipotizzare l'esistenza nei RBM di un meccanismo di apertura del poro di transizione diverso da quello presente negli altri tipi mitocondriali. Nella seconda parte dello studio è riportato il trasporto della serotonina nei mitocondri con la caratterizzazione del sistema di trasporto. Evidenze sperimentali suggeriscono che sia l’aldeide derivata dalle monoamine la possibile specie accumulata. Infine, nella terza parte del lavoro, al fine di definire meglio il processo che innesca la MPT nei RBM, abbiamo studiato il ruolo delle vie di trasmissione del messaggio, in particolare il possibile coinvolgimento di proteine tirosin fosforilate, anche in base al fatto che è stato riportato che questo tipo di mitocondri contiene Tyr-chinasi della famiglia Src. Abbiamo trovato, da un lato, che una serie di inibitori delle tirosin-chinasi non influenzano la MPT, mentre l’”Inhibitor Tyr-phosphatases Cocktail 2”, e il noto inibitore delle fosfatasi pervanadato riducono l'insorgenza di tale processo in parallelo con un aumento del livello P-Tyr di alcune proteine, in particolare, proteine di un apparente massa molecolare 160, 72 e 35 KDa. Esperimenti sono in corso per definire, prima di tutto, l'identità delle proteine fosforilate in tirosina coinvolte in questo processo e quindi le caratteristiche e il significato fisiologico di questo fenomeno. In conclusione i risultati ottenuti mostrano un ruolo importante delle monoamine nei mitocondri che dipende dai tipi di tessuto e dai loro specifici processi fisiologici. Inoltre sembrano essere coinvolti nel processo della MPT due diversi meccanismi. Nei RLM l'apertura del poro di transizione della permeabilità sembra richiedere l'ossidazione dei gruppi tiolici e l'amplificazione della MPT sembra dipendere dallo stress ossidativo indotto da specie reattive dell'ossigeno prodotte dall'ossidazione delle monoamine. Nei RBM l'apertura del poro sembra invece dipendere da due diversi meccanismi: oltre che dallo stress ossidativo anche dalla fosforilazione tirosinica di alcune proteine sulla cui natura si sta attualmente indagando.