Attività antiproliferativa di derivati furocumarinici attivati da blue light in linee cellulari di carcinoma prostatico e vescicale

Prostate and bladder cancer are currently the most common tumors in the male population and those with the highest mortality rates. The latter is related to the high incidence of relapses resulting from a lack of efficacy of available treatments, often characterized by invasiveness and toxicity. A new approach for the management of these cancers could be represented by photochemotherapy where the drugs are directly activated on the diseased area, thus reducing toxicity to neighboring healthy cells. The antiproliferative activity of the compounds, psoralenes and angelicins, following activation with UVA, light is well known and largely due to their ability to interact with DNA forming monoadducts (MAs) and cross-links (XLs). However, the major disadvantage of the use of furocumarins in combination with UVA light is represented by the risk of mutagenicity linked both to their ability to covalently bind the nucleic acid and to the toxicity of the radiation. The possibility of photoactivate this type of molecule with blue light (BL) could represent an innovation in the field of photochemotherapy because it would improve the most common operational limits and side effects connected with the use of UVA. BL, unlike UVA, has a deeper tissue penetration, thus allowing the potential treatment of more invasive tumours, and at the same time has a lower mutagenicity. Moreover, from a technical point of view, the optical fibers used in photodynamic therapy (PDT) have a better performance to deliver BL than UVA both from the point of view of light diffusion and the amount of transmitted radiation. Thiswork has demonstrated that 8-MOP and TMA are able to be photoactivated by BL, despite their low coefficients of molar extinction, and exert an antiproliferative effect on prostate (DU145) and bladder (T24) cancer cell lines. Experiments on isolated DNA have confirmed the ability of these molecules to form MAs and XLs, produce strand breaks and photooxidation of nucleic acid bases when activated by UVA. However, photoactivation by BL induced, both a quantitative decrease and a variation in the type of lesions in the macromolecule. This decrease was far greater in the case of TMA, which, unlike 8-MOP, was unable to form XLs and photooxide DNA after activation with BL. 8-MOP and TMA plus BL had good antiproliferative activity resulting from the induction of the apoptotic process and the formation of ROS. In addition, these molecules modulated the activation status of p38 and ERK1/2 with both types of irradiation. However, TMA had a higher activity than 8-MOP being active at lower doses, and was not genotoxic, as shown by the evaluation of the phosphorylation status of histone H2AX in both DU145 and T24 cells, when irradiated with UVA or BL. TMA/BL also modulated Wnt's canonical signal pathway in a negative way; in fact, it increased the phosphorylated forms of β-catenin and GSK3β (to tyrosine 216) and decreases the nuclear levels of β-catenin. The inhibition of this pathway lead to a decrease in the expression of some of its target genes, such as cyclin D1, c-Myc and CD44v6, as demonstrated by RT-PCR. In addition to decreased expression at transcript level, there was also a reduction in protein expression of CD44 in all samples treated with TMA. The latter was due to the modulation of the phosphorylation state at tyrosine 216 of GSK3β, as suggested by the partial recovery of the expression of nuclear β-catenin and the reduction of its phosphorilated form after treatment with LiCl. The collected data also suggest that the activation status of GSK3β may be mediated by ERK1/2, as TMA/BL induced a decrease in its phosphorylated form. In conclusion, TMA photoactivated by BL may represent an interesting option for photochemotherapy of non-invasive prostate and bladder carcinomas, because this treatment is able to inhibit key pathways for tumour growth and progression in the absence of genotoxic effects.

Il carcinoma protatico e quello vescicale sono le patologie tumorali a maggiore incidenza con i più alti tassi di mortalità. Quest’ultima è connessa all’elevata frequenza di ricadute derivante da una scarsa efficacia dei trattamenti disponibili, spesso caratterizzati da invasività e tossicità. Un nuovo approccio potrebbe essere rappresentato dalla fotochemioterapia nella quale i farmaci vengono attivati per svolgere la loro funzione direttamente sul sito interessato, riducendo quindi la tossicità alle cellule sane limitrofe. L’attività antiproliferativa dei composti usati, psoraleni ed angelicine in associazione con luce UVA, è ben nota ed in gran parte dovuta alla loro capacità di interagire con il DNA formando monoaddotti (MA) e legami crociati (XL). Tuttavia, il maggior svantaggio è rappresentato dal rischio di mutagenicità legato sia alla loro capacità di legare covalentemente l’acido nucleico che alla tossicità della stessa radiazione utilizzata. La possibilità di fotoattivare questo tipo di molecole con blue light (BL) potrebbe rappresentare un’innovazione nel campo della fotochemioterapia poichè BL, diversamente da UVA, possiede una più profonda penetrazione tessutale, permettendo quindi il potenziale trattamento di tumori più invasivi, e al contempo presenta una minore mutagenicità. In questa tesi è stato dimostrato che 8-MOP e TMA, nonostante i loro bassi coefficienti di estinzione molare, sono in grado di essere fotoattivate da BL ed esercitano un effetto antiproliferativo su linee cellulari di tumore prostatico (DU145) e vescicale (T24). Esperimenti su DNA isolato hanno confermato la capacità di queste molecole di formare MA e XL, produrre tagli ai filamenti e fotoossidare le basi dell’acido nucleico quando attivate da UVA; la fotoattivazione mediante BL induceva, invece, sia una diminuzione quantitativa che una variazione nella tipologia delle lesioni alla macromolecola. Questa diminuzione risultava di gran lunga maggiore nel caso di TMA che, al contrario di 8-MOP, in seguito ad attivazione con BL non era in grado di formare XL e di fotoossidare il DNA. L’ attività antiproliferativa di 8-MOP e TMA risultava dall’induzione del processo apoptotico e dalla formazione di ROS. Inoltre, veniva modulato lo stato di attivazione di p38 ed ERK1/2 con entrambe le tipologie di irradiazione. Tuttavia, i dati raccolti hanno evidenziato che TMA possedeva una maggiore efficacia rispetto a 8-MOP essendo attiva a dosi minori. Inoltre, non era genotossica, come mostrato dalla valutazione dello stato di fosforilazione dell’istone H2AX sia nelle cellule DU145 che nelle T24, quando irradiata con UVA o BL. TMA/BL, inoltre, modulava in modo negativo la via di segnale canonica di Wnt; aumentava le forme fosforilate di β-catenina e di GSK3β (tirosina 216) e diminuiva i livelli nucleari di β-catenina. L’inibizione di questa via si traduceva nella diminuzione dell’espressione di ciclina D1, c-Myc e CD44 nella sua variante v6, come evidenziato dalla RT-PCR; per quest’ultima si registrava anche una riduzione dell’espressione proteica. L’inibizione della via Wnt era dovuta alla modulazione dello stato di fosforilazione di GSK3β, come suggerito dal parziale recupero dell’espressione di β-catenina nucleare ed alla riduzione della sua forma fosforilata in seguito a trattamento con LiCl. I dati raccolti hanno suggerito, inoltre, che lo stato di attivazione di GSK3β potesse essere mediato da ERK1/2, in quanto TMA/BL induceva una diminuzione della sua forma fosforilata. In conclusione, TMA fotoattivata da BL può rappresentare un’interessante opzione per la fotochemioterapia dei carcinomi prostatico e vescicale non invasivo, in quanto tale trattamento è in grado di inibire vie chiave per la crescita e la progressione tumorale in assenza di effetti genotossici.