Emerging role of monocytes and of their intracellular calcium content in spondyloarthritis

Background. The Spondyloarthritis (SpA) are a group of a multifactorial diseases characterised by a complex interplay between an inherited background and environmental factors that lead to immune response dysregulation and inflammation of the joints, mainly the sacro-ileal. Different from rheumatoid arthritis, there are no specific biomarkers for disease activity in the SpA that could be used in clinical practice. New biomarkers discovery could be helpful for early diagnosis, monitoring of disease activity, as well as for prognosis, outcome measures, and for assessing treatment efficacy. In SpA patients, macrophages infiltrating the inflamed joints, derive from circulating monocytes, express not only inflammatory cytokines, like TNF-α, IL-1β or TGF-β, but also enzymes causing tissue destruction and remodelling, like metalloproteinases. Metalloproteinases (MMPs), MMP3 in particular, have been reported to be highly expressed in synovial tissue and in peripheral blood of SpA patients. Recent studies have showed that MMP8 and MMP9, in particular, are produced by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) if they are stimulated by calprotectin (S100A8/S100A9 heterodimer). The SpA synovial tissue is characterized by an increased vascularization and an infiltrate composed of nucleated polymorphs, macrophages and lymphocytes. In these cells calcium signals are essential for various cellular functions, including proliferation, differentiation, apoptosis, and gene transcription. The aims of this work are to investigate whether the TNF-α, IL-1β, TGF-β, S100A8, S100A9, MMP3, MMP8 and MMP9 mRNA expression levels and intracellular calcium ([Ca2+]i) fluxes variations in PBMCs might be associated with SpA. Methods. The study population comprised 64 patients with a diagnosis of SpA (39 males and 25 females; mean age±standard deviation: 39.5±13.2 years) and 100 healthy controls (58 males and 42 females; mean age±standard deviation: 46.68.5). Among patients, 26 (40.6%) had diagnosis of Ankylosing Spondylitis (AS), (modified New York criteria) and 38 (59.3%) had a diagnosis of Psoriatic Arthritis (PsA) (CASPAR criteria). Blood samples were collected and complete blood count, CRP, ESR, uric acid, ALT and glucose were evaluated. Relative quantification (Real Time PCR) of TNF-α, IL-1β, TGF-β, S100A8, S100A9, MMP3, MMP8 and MMP9 mRNA were performed. Intracellular calcium ([Ca2+]i) fluxes were studied in patients and controls monocyte cells by a fluorescent microscope. Results. The mRNA expression levels in PBMCs of TNF-α, IL-1β, TGF-β were similar in AS and PsA patients when compared to controls. The variations of TNF-α, TGF-β and IL-1β were correlated each other. TNF-α mRNA expression levels also show a significant correlation if patient’s relatives with SpA where found (t=-2.5386, p=0.013). MMP8 and MMP9 mRNA expression levels did not vary between controls and patients, nor they were related to disease clinical activity indices. S100A9 mRNA expression did not vary, the expression of S100A8 (F=3.29, p=0.039) was reduced in PsA patients. S100A8 and S100A9 expression levels were significantly correlated with circulating inflammatory cells and S100A8 was correlated with CRP and ESR. Monocytes from healthy controls had evident and frequent ([Ca2+]i) oscillations, while SpA patients monocytes did not. The percentage of cells exhibiting ([Ca2+]i) oscillations profile was significantly lower in AS with respect to controls (F=6.15, p=0.003). The percentage of monocytes with intracellular calcium oscillations and the studied molecules were not correlated with the type of therapy or of drug used. Conclusions. SpA associates with a reduced expression of the inflammatory S100A8 calcium binding protein and with a decreased intracellular calcium fluxes in patients' cells compared to healthy subjects, suggesting that the presence of the disease affects the "on-off" mechanisms that regulate the concentration of intracellular calcium.

Introduzione. Le Spondiloartriti (SpA) sono un gruppo di malattie multifattoriali caratterizzate da una complessa interazione tra fattori genetici ed ambientali che determinano una disregolazione del sistema immunitario e l’attivazione di processi infiammatori a livello articolare, in particolar modo nelle articolazioni sacro-iliache. A differenza dell’artrite reumatoide, nelle SpA non esistono dei biomarcatori specifici di attività di malattia che vengono utilizzati nella pratica clinica. Pertanto, la ricerca di nuovi biomarcatori potrebbe essere d’ausilio per una diagnosi precoce e per un adeguato monitoraggio dell’attività di malattia, oltre che essere impiegati come fattori prognostici, misure di outcome e strumenti di valutazione dell’efficacia di trattamento.Nei pazienti con SpA, i macrofagi che infiltrano le articolazioni e che derivano principalmente dai monociti circolanti non esprimono solo citochine infiammatorie come TNF-α, IL-1β o TGF-β ma anche enzimi coinvolti nel rimodellamento tissutale come le metallo proteinasi di matrice (MMPs). La metalloproteinasi di matrice 3 (MMP-3), infatti, è riconosciuta come una molecola altamente espressa nel tessuto sinoviale e nel sangue periferico dei pazienti con SpA. Studi recenti hanno evidenziato che le metallo proteinasi di matrice 8 e 9 (MMP8 e MMP9) vengono prodotte dalle cellule mononucleate derivate da sangue periferico (PBMCs) quando vengono stimolate da calprotectina (eterodimero formato dalle proteine S100A8 e S100A9).Vi è poi una crescente evidenza del ruolo patogenetico nelle Spa svolto dalle cellule appartenenti all’immunità innata quali macrofagi, mastociti e neutrofili; il tessuto sinoviale dei pazienti con SpA infatti è caratterizzato da una elevata vascolarizzazione e quindi da una forte infiltrazione delle cellule immunitarie. In queste cellule i segnali di calcio intracellulare sono essenziali nella regolazione di numerose funzioni cellulari incluse proliferazione, differenziazione, apoptosi e trascrizione genica. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di analizzare i livelli di espressione genica delle molecole TNF-α, IL-1β, TGF-β, S100A8, S100A9, MMP3, MMP8 e MMP9 e di valutare se le variazione dei flussi di calcio intracellulare ([Ca2+]i) nei PBMCs potrebbero essere associati alla presenza di SpA. Metodi.La popolazione studiata comprendeva 64 pazienti con diagnosi di SpA (età media ± deviazione standard: 39.5 ± 13.2 anni; 39 maschi, 25 femmine) e 100 controlli sani (età media ± deviazione standard: 46.6 ± 8.5 anni; 58 maschi, 42 femmine). Tra i pazienti, 26 (40.6%) presentavano spondilite anchilosante (AS) e 38 (59.3%) artrite psoriasica (PsA), con diagnosi formulata sulla base dei criteri rispettivamente di New York e CASPAR. Per ciascun soggetto arruolato, sono stati raccolti i dati demografici e fisiologici, la storia clinica e familiare. Sono stati raccolti poi, campioni di sangue, al fine di valutare l’emocromo e la VES, e di determinare i livelli di PCR, acido urico, prealbumina, alanina aminotransferasi (ALT) e glucosio. Per ciascun soggetto è stata effettuata un’analisi di espressione genica relativa (Real Time PCR) di TNF-α, IL-1β, TGF-β, S100A8, S100A9, MMP3, MMP8 e MMP9. La determinazione dei flussi di calico intracellulare ([Ca2+]i) nei pazienti e nei controlli è stata effettuate mediante microscopio ad epifluorescenza. Risultati. I livelli di espressione genica relativa nei PBMCs delle citochine infiammatorie of TNF-α, IL-1β, TGF-β erano simili nei pazienti con AS e PsA se comparati ai livelli di espressione nei controlli sani. Le variazioni dei livelli di espressione di TNF-α, TGF-β e IL-1β correlavano tra di loro. I livelli di espressione di TNF-α però risultavano correlati in maniera diretta, nei pazienti, con la presenza di una familiarità per la malattia (t=-2.5386, p=0.013). I livelli di espressione di MMP8 e MMP9 non risultavano essere associati con la diagnosi di SpA e non correlavano con gli indici clinici di attività di malattia.Anche i livelli di espressione di S100A9 non risultavano essere associati con la diagnosi di SpA mentre i livelli di espressione di S100A8 (F=3.29, p=0.039) erano ridotti nei pazienti con PsA.I livelli di espressione di S100A8 e S100A9 correlavano in maniera significativa con il numero di cellule infiammatorie circolanti e S100A8 correlava con i valori di PCR e VES. Dall’analisi dei dati ottenuti dai controlli sani e dai pazienti risultava evidente come la maggior parte dei monociti dei soggetti di controllo presentassero pulsazioni regolari di calcio intracellulare a differenza delle cellule ottenute da pazienti.I pazienti affetti da AS presentavano una ridotta percentuale di monociti con oscillazioni dei flussi di calcio intracellulare rispetto ai controlli sani (F=6.15, p=0.003). La percentuale di monociti con variazione di calcio intracellulare e l’ espressione delle molecole studiate non risultavano essere correlati ne con il tipo di terapia ne con il tipo di farmaco utilizzato. Conclusioni. In conclusione, I risultati di questo studio hanno evidenziato che nei pazienti con SpA vi è una ridotta espressione della proteina legante calcio S100A8 e vi è un decremento dei flussi di calcio intracellulare rispetto ai controlli sani, suggerendo che la presenza della malattia influenza i meccanismi "on-off" che regolano la concentrazione di calcio intracellulare.