A possible role of superoxide dismutase 2 in the pathogenesis of parkinson disease

Parkinson disease is the second most common neurodegenerative disorder after Alzheimer disease. Less than the 5% of the cases are associated with recessive or dominant Mendelian inheritance. It is characterized by tremor at rest, bradykinesia, postural instability and rigidity. The pathogenesis is still unknow but evidence suggests multifactorial mechanisms. In particular, mitochondrial dysfunction and oxidative stress are believed to have a central role in the pathology. The hallmark of PD is the loss of dopaminergic neurons of substantia nigra pars compacta, hence dopamine may play an important role in the etiology due its metabolism. In fact, the cytosolic oxidation of dopamine may be very deleterious to neurons. This neurotransmitter, once synthesized, is sequestered in acid vesicles. However, mitochondrial dysfunction, in particular the inhibition of the complex I, causes ATP depletion, which can perturb the H+-ATPase necessary to drive the dopamine into vesicles. The consequence will be a redistribution of the neurotransmitter in cytoplasm, where it can auto-oxidize spontaneously at alkaline pH yielding reactive dopamine quinones (DAQs) and reactive oxygen species (ROS) contributing to oxidative stress. DAQs are suggested to be involved in dopaminergic neurotoxicity because they can form adducts with cysteine residues exposed at the surface of proteins to generate 5-S-cysteinyl-DA. The covalent modification of proteins could lead to the impairment of their functional properties. The cells have different mechanisms to protect from oxidative stress: catalase, glutathione peroxidise and superoxide dismutase (SOD). The function of SOD enzymes consists in the dismutation of superoxide anions to hydrogen peroxide and molecular oxygen. Among the three different isoforms of SOD, SOD2 is particularly important due its mitochondrial localization. Mitochondria are in fact the main source of superoxide anions. The aim of this thesis is to investigate if SOD2 is a target of DAQs in vitro, the effects of this interaction on the enzymatic function of the protein and the residue/s target of DAQs. The starting point was the cloning of the cDNA of the human SOD2 in the pET28a+ vector. Since E.coli present 3 different SOD that could potentially interfere with the purification, a second cloning was obtained, in which the cDNA was inserted downstream a cleavable His-tag. A protocol of SOD2 purification was set up but a control purification, where the cells were transformed with empty vector, led to purify an endogenous SOD of E.coli demonstrating that a E.coli SOD co-purify with the human recombinant enzyme. To avoid the co-purification, a protocol of purification was optimized for the protein with the His-tag leading to obtain 40-60 mg of protein per 1 liter of culture. The interaction between SOD2 and DAQs was investigated using different biochemical and biophysical techniques. Dopamine oxidation was induced by the addition of tyrosinase, which prevented the formation of radical species normally produced during dopamine auto-oxidation. It was verified that the protein did not interact with tyrosine residues of SOD2. The protein was incubated with dopamine at different ratio SOD2: dopamine in the presence of tyrosinase, following by UV-vis spectroscopy the formation of DAQs. The interaction of these products with the protein was studied by mass spectrometry analysis, which revealed the formations of new species whose molecular masses are compatible with the covalent modification of one cystiene residue with dopamine-o-quinone and with the indole 5,6 quinone. Other species were detected, however they were not attribuible to a specific DAQ, hence they might result from more complex interactions. Moreover, the presence of +287.8 Da product suggested the interaction of both the cystiene residues. SDS-PAGE analysis of the reaction products revealed the presence of the protein dimer and aggregates. Native-PAGE showed multiple bands and aggregates upon the interaction with DAQs. The multiple band profile was assigned to the combination of tetramers with monomers of SOD2 with different modifications (as demonstrated by mass analysis). This was supported by 2 dimensional gel, where at least 4 products of SOD2 with different isoelectric point appeared. Activity assay indicated inhibition of proten covalently modified by DAQs. Hence, pulse radiolysis measurements were performed to determine the kinetic parameters of the dismutation reaction. Data are currently under processing. To identify the site of DAQs interaction, the cysteine residues were mutagenized obtaining the following mutated proteins: C140A, C196A and C140A/C196A. Incubation of the mutants incubated C14 labeled dopamine demonstrated that the cysteine 196 was the primary target of DAQs. This result was confirmed also by mass spectrometry. The enzymatic activity of the mutant C140A upon interaction of dopamine proved to be lower in comparison with the unmodified protein. A weakly positive radioactivite signal was found also in association with the mutant C196A and the C140A/C196A suggesting secondary site of DAQs interaction. Since two covalent DAQ-derivatives were found by mass spectrometry after the incubation of the mutant C140A with dopamine, the existence of a second site of interaction probably another nucleophilic residue is suggested. Structural changes of SOD2 upon DAQs modification suggested protein precipitation and a possible change in tertiary structure. HFEPR spectra did not show any significant changes in metal coordination. The results presented in this thesis demonstrate that SOD2 is covalently modified by DAQs in vitro. This suggests a possible role of SOD2 in the PD. The idea is that SOD2 can be covalently modified by DAQs in mitochondria. This would increase the oxidative stress in mitochondria, due to the decrease of dismutase activity of the target protein, ultimately determining mitochondrial dysfunction and contributing to the neuron cell death.

La malattia di Parkinson è la malattia neurologica degenerativa più diffusa dopo la malattia di Alzheimer. Meno del 5% dei casi presenta una correlazione genetica (ereditarietà autosomica dominante o recessiva). I sintomi principali caratteristici sono tremore a riposo, bradicinesia, instabilità posturale e rigidità. L’eziologia rimane ancora sconosciuta ma evidenze perimentali suggeriscono che la malattia sia multifattoriale. In particolare due fattori, disfunzione mitocondriale e stress ossidativo, sembrano avere un ruolo chiave nella patogenesi. La caratteristica della malattia di Parkinson è la perdita dei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta. Questo fa presupporre che la dopamina abbia un ruolo importante nell’eziologia attraverso il suo metabolismo. Infatti, l’ossidazione citosolica della dopamina può contribuire alla tossicità neuronale. Questo neurotrasmettitore, una volta sintetizzato, in condizioni normali è sequestrato nelle vescicole sinaptiche. Tuttavia, la disfunzione mitocondriale, in particolare l’inibizione a livello del complesso I riscontrata nella malattia di Parkinson, porta a causare una diminuzione dei livelli di ATP. Questo può influenzare il trasporto di dopamina nelle vescicole che è ATP-dipendente. La conseguenza sarebbe una ridistribuzione del neurotrasmettitore nel citoplasma, dove può auto-ossidarsi spontaneamente a pH alcalini producendo dopaminochinoni (DAQs) e specie reattive dell’ossigeno (ROS) che contribuiscono allo stress ossidativo. E’ stato suggerito che i DAQs possano essere coinvolti nella neurotossicità dei neuroni dopaminergici. Questo perchè possono interagire con le cisteine esposte sulla superficie di proteine generando 5-S-cisteinil-DA e la loro modificazione covalente da parte dei DAQs può compromettere la funzionalità e stabilità di queste proteine. Le cellule possiedono differenti meccanismi per proteggersi dallo stress ossidativo: catalasi, glutatione perossidasi e superossido dismutasi (SOD). La funzione delle SOD consiste nel dismutare l’anione superossido a perossido d’idrogeno e ossigeno molecolare. Tra le tre isoforme di SOD presenti nell’uomo, la SOD2 è particolarmente importante a causa della sua localizzazione all’interno del mitocondrio. Lo scopo di questa tesi è quello di investigare se la SOD2 sia un target dei DAQs in vitro, gli effetti di questa interazione sull’attività enzimatica della proteina e il/l residuo/i target dei DAQs. Il punto di partenza è stato il clonaggio del cDNA della SOD2 umana nel vettore pET28a+. Dato che E.coli possiede tre differenti SOD che potrebbero interferire con la purificazione, un secondo clonaggio è stato effettuato, clonando l’inserto a valle di un histidine-tag. È stato messo a punto un protocollo di purificazione della SOD2 ma la purificazione di controllo, dove le cellule erano state trasformate con il vettore senza l’inserto, ha portato alla purificazione di una SOD endogena di coli. Questo ha dimostrato che una SOD di coli co-purificava con l’enzima umano ricombinante. Per evitare questo, un protocollo di purificazione è stato ottimizzato con l’His-tag ottenendo 40-60 mg di proteina da un litro di coltura. L’interazione tra la SOD2 e i DAQs è stata indagata utilizzando differenti tecniche biochimiche e biofisiche. L’ossidazione della dopamina è stata indotta dall’aggiunta di tirosinasi, che previene la formazione di specie radicaliche normalmente prodotte durante la sua auto-ossidazione. È stato verificato che la tirosinasi non interagisce con i residui tirosinici della proteina. La SOD2 è stata incubata con differenti rapporti SOD2:dopamina in presenza di tirosinasi, seguendo la formazione dei DAQs con spettroscopia UV-visibile. L’interazione di questi prodotti con la proteina è stata studiata tramite spettrometria di massa, che ha rilevato la formazione di nuove specie le cui masse erano compatibili con la modificazione covalente di una cisteina con il dopamino-o-chinone e con l’indolo 5,6 chinone. Altre specie sono state identificate ma non è stato possibile attribuirle ad uno specifico chinone, quindi queste potrebbero essere il risultato di interazioni più complesse. Inoltre, la presenza di una doppia modifica ha suggerito la possibile interazione di entrambe le cisteine della proteina. Analisi su SDS-PAGE dei prodotti di reazione ha mostrato la presenza di dimeri di proteina e aggregati. Native-PAGE ha rilevato un pattern di bande multiple e aggregati, dopo interazione con i chinoni. Il profilo delle bande multiple è stato attribuito alla combinazione monomeri di SOD2 con differenti modifiche (come dimostrato dalle analisi di spettrometria di massa) associati a formare tetrameri. Questo è supportato dal profilo nel gel bidimensionale, dove sono presenti 4 prodotti di SOD2 con differente punto isoelettrico. Il saggio enzimatico ha rilevato che la proteina modificata ovalentemente dai DAQs risulta essere inibita. Misure di radiolisi pulsata sono state effettuate per determinare i parametri cinetici della reazione di dismutazione. Per identificare i siti di interazione dei DAQs, le cisteine sono state mutagenizzate in alanine ottenendo i seguenti mutanti: C140A, C196A e C140A/C196A. L’incubazione dei mutanti con C14-dopamina ha dimostrato che il target primario dei DAQs è la cisteina 196. Questo risultato è stato confermato anche da analisi di spettrometria di massa. L’attività enzimatica del mutante 140 dopo interazione con DAQs risulta essere minore rispetto alla proteina non modificata. Un debole segnale di radioattività è stato trovato anche in associazione con il mutante 196 e il doppio. Ciò suggerisce la presenze di un sito di interazione con i chinoni secondario. Dato che due modificazioni dovute a DAQs sono state trovate incubando il mutante C140A, si deduce che il secondo sito di interazione coinvolga un altro residuo nucleofilo. Cambiamenti strutturali della SOD2 suggeriscono precipitazione della proteina un possibile cambiamento della struttura terziaria. Inoltre modificazioni rilevanti nella coordinazione del metallo non sono state rilevate mediante HFEPR. I risultati presentati in questa tesi dimostrano che la SOD2 è un target dei DAQs in vitro suggerendo l’idea che la SOD2 possa essere coinvolta nella malattia di Parkinson. Una volta modificata dai DAQs, lo stress ossidativo aumenterebbe nei mitocondri, a causa della inibizione dell’attività dismutasica dell’enzima, determinando disfunzione mitocondriale e contribuendo alla morte neuronale.