G-quadruplexes in the HIV-1 LTR promoter: targeting and binding proteins

G-quadruplexes (G4s) are non-canonical nucleic acids secondary structures that may form in G-rich sequences and regulate key biological processes. We have previously identified three mutually exclusive and functionally significant G4s in the unique long terminal repeat (LTR) promoter of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1): their formation decreases viral transcription, with an effect that is enhanced by the presence of the cellular protein nucleolin and G4 ligands. Given that most available G4 binders display yet insufficient selectivity towards different G4s, we explored the possibility to selectively target LTR G4s, challenge which constitutes the basis for the development of anti-HIV-1 compounds with unprecedented mechanism of action. By screening of a commercially available library of drug-like small molecules, we found a new class of compounds that displayed a clear-cut selectivity for viral over cellular G4s and showed a promising G4-mediated antiviral activity. In addition, we proposed a conceptually new approach to selectively target G4s, which was successfully tested on HIV-1 LTR-IV G4. We employed naphthalene diimide-peptide nucleic acid (NDI-PNA) conjugates to combine the stabilizing activity of a G4 ligand, with fingerprint recognition of the nucleotide sequence proximal to the G4 of interest. The conjugate was able to stabilize LTR-IV G4 through the NDI, and, at the same time, to prevent the formation of the most stable G4 (LTR-III) by a PNA specifically designed to bind the 5’-flanking region of LTR-IV G4. The NDI-PNA was also successfully modified with a nuclear localization signal (NLS) to achieve cell entry without affecting activity. This innovative method is fundamental to reach the specific discrimination between LTR-III and LTR-IV G4s, whose balance seems to act as regulatory element of the viral promoter. It could be used to modulate the folding and unfolding of unique G4s within the full-length LTR G-rich sequence in order to better investigate their single role and function. Overall, these findings clearly highlight the possibility to selectively recognize G4s through both small molecules and NDI-PNA conjugates and pave the way to develop novel antiviral compounds that may complement current clinical AIDS therapies. Finally we looked for new proteins that specifically recognize LTR G4s and modulate the folding/unfolding of these structures. We identified and characterized the cellular protein hnRNP A2/B1, the first one shown to unfold G4s in the HIV-1 LTR promoter. We thus present new insights in the regulation mechanisms of HIV-1 transcription and we propose a new possible target for the design of specific inhibitors.

I G-quadruplex sono strutture secondarie non canoniche che gli acidi nucleici possono formare in regioni ricche di guanine e regolano importanti processi biologici. Il nostro gruppo di ricerca ha identificato tre G-quadruplex mutualmente esclusivi e rilevanti dal punto di vista funzionale, localizzati nella regione LTR del promotore del virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1): la loro formazione inibisce la trascrizione virale, effetto che è incrementato dalla proteina cellulare nucleolina e da ligandi specifici. Poiché la maggior parte di composti leganti G-quadruplex conosciuti non sono in grado di riconoscere in modo sufficientemente selettivo G-quadruplex diversi, noi abbiamo indagato la possibilità di riconoscere in modo selettivo i G-quadruplex nella regione LTR di HIV-1, concetto alla base dello sviluppo di nuovi composti anti-HIV-1 caratterizzati da un innovativo meccanismo d’azione. Attraverso lo screening di una libreria commerciale di piccole molecole farmaco-simili, abbiamo identificato una nuova classe di composti con una netta selettività per i G-quadruplex virali rispetto a quelli cellulari e una promettente attività antivirale G-quadruplex mediata. Inoltre, abbiamo proposto un approccio completamente innovativo per il riconoscimento selettivo dei G-quadruplex, il quale è stato testato con successo sui G-quadruplex della regione LTR di HIV-1. A tale scopo, abbiamo utilizzato un coniugato formato da una naphthalene diimide (NDI) e da un PNA, con l’obiettivo di combinare la stabilizzazione di un composto legante G-quadruplex con il riconoscimento specifico della sequenza nucleotidica prossimale al G-quadruplex di interesse. L’utilizzo del coniugato ha permesso di stabilizzare in modo specifico il G-quadruplex LTR-IV attraverso la porzione NDI, allo stesso tempo prevenendo la formazione del G-quadruplex più stabile (dLTR-III), grazie alla presenza di un PNA disegnato per legare la regione fiancheggiante LTR-IV in posizione 5’. Il coniugato è stato inoltre implementato con una sequenza di localizzazione nucleare (NLS) per permettere l’entrata nelle cellule, senza interferire con la sua attività specifica. Questa strategia innovativa è fondamentale per riuscire a discriminare in modo specifico LTR-III e LTR-IV, il cui equilibrio sembra essere un elemento regolatore del promotore virale. Potrà inoltre essere utilizzato per modulare la formazione e la destabilizzazione di specifici singoli G-quadruplex all’interno della sequenza di lunghezza completa ricca in guanine della regione LTR, con lo scopo di investigare meglio il loro singolo ruolo e funzione. Complessivamente, questi risultati evidenziano la possibilità di riconoscere in modo selettivo i G-quadruplex attraverso l’utilizzo sia di piccole molecole sia di coniugati NDI-PNA e aprono la strada per lo sviluppo di nuovi composti antivirali che possono affiancare l’attuale terapia clinica per l’AIDS. Infine, abbiamo ricercato nuove proteine che riconoscano in modo specifico i G-quadruplex nella regione LTR di HIV-1 e modulino la loro stabilizzazione/destabilizzazione. Abbiamo identificato e caratterizzato, hnRNP A2/B1, la prima proteina cellulare in grado di destabilizzare i G-quadruplex nella regione LTR di HIV-1. Abbiamo quindi mostrato nuove evidenze nel meccanismo regolatorio della trascrizione di HIV-1, proponendo inoltre un nuovo possibile bersaglio per lo sviluppo di inibitori specifici.