Applicazione comparativa di metodiche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) nella diagnosi di Neurofibromatosi di tipo 1

Neurofibromatosis type 1 is one of the most frequent autosomal dominant diseases affecting 1 in 3000 individual worldwide. This disorder is caused by heterozygous inactivating mutations of NF1, a large gene that encodes neurofibromin, a negative regulator of the RAS pathway. The mutation rate at the NF1 locus is one of the highest reported in any human disorder; this observation is reflected in the finding that almost 50% of all NF1 patients exhibit a de novo NF1 mutation. More than 1900 different NF1 mutations have been reported and listed in the Leiden Open Variation Database (LOVD). Splicing defects appear to be the most common molecular defect in NF1: 50% of point mutations cause splicing alterations that can determine elimination of one or more exons (exon skipping) or inclusion of introns. Molecular diagnosis of NF1 is difficult because of the large size of the gene, the existence of highly identical pseudogenes, the lack of mutational hotspots and the complex mutational spectrum. At present, molecular diagnostics of NF1 utilize Sanger sequencing with either mRNA and/or genomic DNA as the starting material. The traditional methods can yield excellent results but are expensive, time-consuming and labor-intensive. With the rapid development of next generation sequencing (NGS) machines, molecular biology is in a new revolutionary phase. This new technology combines high performance with much less expensive operation costs. The purpose of the present study was to develop an NF1 mutation analysis method to use the NGS machine MiSeq Dx in diagnostic settings for Neurofibromatosis type 1. We used and compared two different approach of next generation sequencing for NF1 gene analysis, one based on mRNA (cDNA) analysis and the other one on genomic DNA analysis. 80 unrelated subjects with suspected NF1 phenotypes were analyzed for mutations in the NF1 gene. 24 patients were analyzed using the cDNA-based approach while 20 patients were analyzed with the other approach based on gDNA as starting material. In order to compare the properties of each method, 36 patients were subjected to NGS sequencing from both cDNA and gDNA. The overall mutation detection rate of the two reported methods was 61,1% (22/36) with 22 pathogenic mutations identified by the gDNA approach and 16 mutations identified by cDNA approach. Then all the negative cases (14/36, 38,9%) were analyzed also by Sanger sequencing using cDNA or gDNA and/or by MLPA technique to exclude multi-exon deletion/duplication. In only one case DNA Sanger sequencing detected a mutation previously unidentified by the two NGS methods. Analyzing results retrospectively, gDNA analysis shows a mutation detection rate of 95,7% (22/23), with a single false negative result. cDNA analysis, on the other hand, shows a mutation detection rate equal to 69,6% (16/23) with 7 false negative results. Although cDNA analysis allows direct observation of the effects of splicing mutations, the system shows some bioinformatic limitations that do not allow a complete detection of variants. The instrument alignment tool eliminates reads that do not pair for more than 25 nucleotides in a row with the NF1 transcript reference sequence. It means that it is impossible to identify splicing mutations that determine deletions of more than 25 bp in the transcript. This could explain the false negative results obtained by cDNA analysis: the method is not able to identify intron splicing mutations that are likely to determine deletion of many nucleotides. Differently, gDNA NGS sequencing shows a more efficient workflow that can be easily applied in the diagnostics field for the NF1 gene molecular analysis. The use of genomic DNA as starting material is much easier in clinical settings, allowing you to process more than 50 samples at the same time, without additional preparation step. This method shows high sensitivity and specificity and represent a good strategy for the detection of NF1 mutations using genomic DNA. Our study provides proof of principle of the feasibility and the potential of next generation sequencing techniques in the molecular diagnosis of Neurofibromatosis type 1. Adopting this assay in the diagnostic setting could significantly improve cost- and time-effectiveness and ensure a high overall mutation rate.

La Neurofibromatosi di tipo 1 è la forma più comune di neurofibromatosi con una frequenza nella popolazione di 1 su 3000 nati vivi. La malattia presenta una trasmissione di tipo autosomico dominante e ha un’origine familiare soltanto nel 50% dei casi. Il restante 50% è causato da una mutazione de novo: ne deriva che la NF1 è una delle patologie a più alta frequenza di mutazioni insorte in maniera sporadica. La malattia è causata da mutazioni “loss of function” del gene NF1 che codifica per la neurofibromina, proteina coinvolta nella regolazione negativa della via di segnale di Ras. Le mutazioni a carico del gene NF1 sono estremamente numerose e di diversa tipologia: ad oggi ne sono state riportate oltre 1900 nel database LOVD (Leiden Open Variation Database). I difetti di splicing rappresentano il difetto molecolare più comune nella NF1: circa il 50% delle mutazioni puntiformi del gene NF1 causa l’alterazione dei siti di splicing con conseguente esclusione di uno o più esoni (exon skipping) o la ritenzione degli introni. L’analisi molecolare del gene NF1 per la ricerca di mutazioni è piuttosto complicata per diverse ragioni che includono le grandi dimensioni del gene, la presenza di pseudogeni altamente omologhi al gene NF1, la mancanza di hot spots mutazionali e il complesso spettro mutazionale. Ad oggi la diagnosi molecolare di NF1 si basa sul sequenziamento Sanger del gene a partire da mRNA e/o da DNA genomico. L’approccio tradizionale permette di ottenere dati di sequenza molto accurati ma risulta piuttosto laborioso, costoso e richiede tempi estremamente lunghi. Lo sviluppo di piattaforme di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha dato un nuovo impulso al mondo della biologia molecolare. La tecnologia NGS, che implementa un sistema dotato di maggiore processività per la lettura delle sequenze in parallelo, è in grado di produrre grandi quantità di dati riducendo i tempi e i costi impiegati. L’obiettivo di questo studio è stato verificare l’applicabilità di metodiche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per l’analisi del gene NF1 da introdurre nella pratica diagnostica di laboratorio. In particolare, sono stati adottati due diversi approcci di sequenziamento di nuova generazione basati sull’utilizzo di cDNA o di DNA genomico come materiale di partenza e sull’impiego della piattaforma MiSeq Dx (Illumina). Per lo studio sono stati analizzati 80 pazienti con diagnosi clinica, o sospetta diagnosi, di Neurofibromatosi di tipo 1. 24 pazienti sono stati analizzati a partire da cDNA mentre per 20 pazienti l’analisi è stata condotta da DNA genomico. Al fine di comparare le potenzialità delle due diverse metodiche nell’analisi del gene NF1, 36 pazienti sono stati sottoposti a sequenziamento NGS sia da cDNA che da gDNA. Le due metodiche hanno individuato complessivamente 22 mutazioni patogenetiche (22/36, 61,1%); nello specifico, l’analisi da gDNA ha rilevato tutte le 22 mutazioni, mentre l’analisi da cDNA ne ha individuate soltanto 16, dando un risultato negativo, o identificando una variante non corretta, in 6 casi. Per i soggetti risultati negativi all’analisi tramite sequenziamento NGS (14/36, 38,9%), l’indagine molecolare è proseguita con la ricerca di eventuali mutazioni patogenetiche tramite analisi Sanger da DNA o RNA o, alternativamente, tramite MLPA, così da escludere la presenza di delezioni/duplicazioni multiesoniche. In un solo caso il sequenziamento Sanger da DNA ha individuato una mutazione non identificata con le due metodiche. Analizzando i risultati in maniera retrospettiva, l’analisi da gDNA mostra una “detection rate” del 95,7% (22/23), con un solo risultato falso negativo. L’analisi da cDNA, invece, presenta una “detection rate” pari al 69,6% (16/23) con 7 risultati falsi negativi. Sebbene l’analisi da cDNA permetta di osservare direttamente gli effetti delle mutazioni di splicing, il sistema mostra alcune limitazioni bioinformatiche che non permettono una completa detection delle varianti. L’algoritmo di allineamento dello strumento elimina tutte le reads di sequenza che non si appaiano per più di 25 nucleotidi consecutivi alla sequenza di riferimento del trascritto del gene NF1; ne deriva che mutazioni di splicing che determinano nel trascritto delezioni superiori a 25 bp non vengono identificate. Questo aspetto potrebbe giustificare i risultati falsi negativi ottenuti dall’analisi da cDNA relativi all’identificazione di mutazioni introniche di splicing che con tutta probabilità determinano nel trascritto la perdita di numerosi nucleotidi. Al contrario, il sequenziamento NGS da gDNA mostra un workflow più lineare facilmente applicabile in campo diagnostico per l’analisi molecolare del gene NF1. L’utilizzo del DNA genomico come materiale di partenza rende la metodica più rapida, permettendo di processare parallelamente oltre 50 campioni, senza ulteriori step di preparazione. La sua applicazione si è rivelata estremamente sensibile e specifica, costituendo una buona strategia per la detection di mutazioni a partire da DNA genomico. In conclusione, le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione rappresentano una valida strategia per l’analisi dei pazienti affetti da Neurofibromatosi di tipo 1, permettendo di ridurre notevolmente i tempi e i costi previsti per l’analisi di un gene complesso come NF1.