Skin receptors agonists as novel adjuvants for Meningococcal glycoconjugate vaccines: the impact of antigen-agonist conjugation and evaluation of intradermal vaccine delivery as an alternative to the intramuscular route

Vaccines are complex multi-component products, in which an interdependent relationship among constituents exists: the concomitant inclusion of antigens, adjuvants, and excipients is essential to guarantee the efficacy of the final product. The selection of adjuvants and formulation criteria is a fundamental aspect, having implications towards efficacy, safety and stability of vaccines. In this field, the work was aimed at the design, formulation and characterization of novel vaccines suitable for intradermal delivery and able to induce earlier onset of immune response as well as more potent and longer lasting immune responses in comparison to conventional vaccines. With this purpose two different model antigens were used to evaluate the intradermal route as immunological target for vaccination: MenC-CRM_197 glycoconjugate and CRM_197 protein (detoxified diphtheria toxin). Moreover different adjuvants were tested to potentiate and modulate the immune responses towards a desired quality profile. The impact of adjuvant-antigen conjugation on immune response against the antigen was investigated in comparison to the adjuvant/antigen co-delivery. For the first time, the intradermal delivery was evaluated as route for the administration of a MenC-CRM_197 glycoconjugate vaccine. LT mutant (LTK63), MPL (TLR4a), Toll like receptor 7 agonist (TLR7a), αGalCer analog, Dectin-1 receptor agonist (β-(1-3)glucan hexasaccharide) and an oil in water (o/w) emulsion have been chosen to target the skin-resident antigen-presenting cells and to enhance the immune response against the antigen. The in vivo evaluation of such novel formulations provided encouraging results with respect to quantity, quality and functionality of the induced immune responses. Notably, the intradermal delivery of MenC-CRM_197 glycoconjugate showed superiority in term of immunogenicity and serum bactericidal titers compared to the intramuscular administration, highlighting the power of the intradermal route for glycoconjugate vaccine delivery. Moreover, the addition of LTK63, TLR4a, TLR7a, αGalCer analog adjuvants allowed the reduction of the number of doses administered and especially LTK63, TLR4a, TLR7a adjuvants were able to modulate the quality of the immune response towards a more beneficial, for the model antigen used, Th1 response. No adjuvant effect was observed when formulations were combined with (β-(1-3) glucan hexasaccharide. When MenC-CRM_197+TLR4a formulation was intradermally delivered in combination with the o/w emulsion adjuvant no additional improvements in immunogenicity were observed in comparison to the single adjuvant effect. The immune system activation was also investigated using a protein model antigen 〖(CRM〗_197) intradermally; however no improvements in term of immunogenity were observed in comparison to the intramuscular administration. This finding has specified the interest in selecting a glycoconjugate antigen to exploit the advantages of the intradermal route in terms of immunogenicity. To further investigate the role of adjuvant and to ensure codelivery of adjuvant/antigen, the conjugations of TLR7a to the glycoconjugate model antigen have been investigated. Two different approaches were developed: the conjugation of TLR7a to MenC polysaccharide and to CRM_197 carrier protein. When the conjugation of TLR7a to CRM_197 carrier protein was tested in vivo, results clearly showed that conjugation of the TLR7a enhances the anti-carbohydrate response. This effect was less pronounced than after co-administration of a commercial glycoconjugate with a standard dose of TLR7a adsorbed on AlumOH. Conjugation of the small immunopotentiator molecule was particularly suited for vaccination via intradermal delivery, where insoluble salts of aluminum cannot be used because of their reactogenicity. These findings have opened the path to the rational design of improved adjuvanted glycoconjugate vaccines for intradermal routes. Regarding the conjugation of TLR7a to MenC polysaccharide tested in vivo, the obtained results have shown a negative impact of the conjugation to MenC polysaccharide receptor recognition and consequently a reduction of the anti-MenC carbohydrate response. In order to investigate the potential use of a short β-glucan chain as adjuvant for intradermal vaccination toward the CRM_197 protein model antigen, in comparison to the previously presented glycoconjugate model antigen, the results obtained by the in vitro and in vivo evaluation of the β-glucan conjugation to the CRM_197 protein were reported. The results have demonstrated that receptor activation was significantly impacted by the presentation of the glucan conjugated to the protein antigen. Considering that glycoconjugate vaccines are some of the safest and most effective vaccines for reducing, even eradicating, infectious diseases, the conjugation of well-defined synthetic glucans could represent a useful strategy for developing new glycoconjugate vaccines for intradermal delivery, with inherent adjuvant properties. The combination of antigens and adjuvants needs to be rationally defined to develop stable formulations and to give the safest and most efficient response with respect to the considered pathogen and route of administration. In the present work, formulation science has been proposed as a key element of novel vaccine development suitable for intradermal delivery.

I vaccini sono prodotti complessi costituiti da più componenti, nei quali esiste un rapporto di interdipendenza tra i costituenti: la concomitante presenza di antigeni, adiuvanti, ed eccipienti è essenziale per garantire l'efficacia del prodotto finale. La selezione degli adiuvanti e i criteri di formulazione sono un aspetto fondamentale, avendo implicazioni su efficacia, sicurezza e stabilità dei vaccini. In questo ambito, il lavoro è stato finalizzato alla progettazione, formulazione e caratterizzazione di nuovi vaccini atti alla consegna per via intradermica e capaci di indurre uno sviluppo precoce, più intenso e più duraturo della risposta immunitaria rispetto ai vaccini convenzionali. Con questo scopo due diversi antigeni sono stati utilizzati come modello per valutare la via di somministrazione intradermica per la vaccinazione: il glicoconiugato MenC-CRM_197 e la proteina CRM_197 (tossina difterica detossificata). Inoltre diversi adiuvanti sono stati usati per potenziare e modulare le risposte immunitarie verso un profilo di qualità desiderata. In aggiunta è stato valutato l'impatto che la coniugazione dell’adiuvante all’antigene ha sulla risposta immunitaria contro l'antigene in confronto alla semplice miscelazione. La via di immunizzazione intradermica è stata valutata, per la prima volta, per la somministrazione del glicoconiugato MenC-CRM_197. Per dirigere l’antigene verso le cellule APC presenti nella pelle e migliorare la risposta immunitaria verso l’antigene, sono stati testati diversi adiuvanti, quali la tossina enterica detossificata di Escherichia coli (LTK63), un agonista del recettore Toll Like 4 (TLR4a) il monofosfolipide A (MPL), un agonista del recettore Toll like 7 (TLR7a), un analogo dell’αGalCer, un agonista del recettore Dectin-1 (β- (1-3) hexasaccharide glucano) e l’emulsione olio/acqua (o/w). La valutazione in vivo di tali nuove formulazioni ha fornito alcuni risultati incoraggianti riguardanti la quantità e la qualità delle risposte immunitarie indotte. In particolare, i risultati immunologici ottenuti hanno dimostrato una netta superiorità della via di immunizzazione intradermica rispetto a quella intramuscolare quando è utilizzato il glicoconiugato MenC-CRM_197. Inoltre, l'aggiunta degli adiuvanti LTK63, TLR4a, TLR7a, l’analogo dell’αGalCer ha consentito la riduzione del numero di dosi somministrate e soprattutto le formulazioni adiuvantate con LTK63, TLR4a e TLR7a sono state in grado di modulare la qualità della risposta immunitaria verso una più vantaggiosa risposta Th1. Nessun effetto adiuvante è stato osservato utilizzando il glucano esasaccarico come adiuvante miscelato all’antigene. Il glicoconigato MenC-CRM_197 adiuvantato con il TLR4a è stato consegnato per via intradermica anche in combinazione con l’emulsione o/w, ma non è stato osservato alcun effetto adiuvante aggiuntivo della miscela in confronto all’effetto dei singoli immunopotenziatori. In aggiunta è stata valutata l’immunogenicità della proteina CRM_197 a seguito della consegna intradermica ma non è stato osservato alcun miglioramento in termini di immunogenicità in confronto alla somministrazione intramuscolare. Questo risultato ha messo in evidenza l'importanza dell’adeguata scelta dell’antigene per sfruttare i vantaggi della via di immunizzazione intradermica: un antigene glicoconiugato è preferibile ad un antigene proteico. Per meglio definire l’effetto adiuvante e garantire la concomitante somministrazione di antigene e adiuvante, sono stati svilippati e studiati due approcci di coniugazione del TLR7a all'antigene modello MenC-CRM_197: la coniugazione del TLR7a prima al polisaccaride MenC e poi alla proteina CRM_197. I risultati ottenuti dai tests in vivo del coniugato TLR7a alla proteina CRM_197 hanno dimostrato che la coniugazione del TLR7a migliora la risposta anti-MenC. L’effetto adiuvante del TLR7a coniugato si è rivelato meno pronunciato rispetto alla somministrazione di una dose standard di TLR7a adsorbito su AlumOH. Bisogna però sottolineare che il sale di alluminio non può essere consegnato per via intradermica, dato la sua reattogenicità, perciò ne risulta che la coniugazione del TLR7a alla proteina del glicoconiugato MenC-CRM_197 può essere molto utile per la vaccinazione intradermica. I risultati ottenuti costituiscono la base per una razionale progettazione di vaccini glicoconiugati adiuvantati da somministrare per via intradermica. Per quanto riguarda l’approccio di coniugazione del TLR7a al MenC, i risultati ottenuti in vivo hanno portato alla luce un impatto negativo della coniugazione sul riconoscimento recettoriale del polisaccaride e di conseguenza una riduzione della risposta anti-MenC. Il glucano esasaccaridico è stato utilizzato per studiare il suo effetto adiuvante quando coniugato ad un antigene proteico a seguito di una somministrazione intradermica. I risultati ottenuti dalla sperimentazione in vitro ed in vivo dell’esasaccaride coniugato alla proteina CRM_197 hanno dimostrato che l'attivazione del recettore Dectin-1 è significativamente influenzata dalla presenza del glucano. Considerando che i vaccini glicoconiugati sono alcuni dei vaccini più sicuri e più efficaci per ridurre e sradicare le malattie infettive, la coniugazione di glucani sintetici potrebbe rappresentare una strategia utile per lo sviluppo di nuovi vaccini glicoconiugati adatti alla somministrazione intradermica, con intrinseche proprietà adiuvanti. La combinazione appropriata di antigeni e adiuvanti deve guidare la formulazione di vaccini stabili che forniscano una risposta più sicura ed efficace contro il patogeno desiderato mediante la via di somministrazione scelta. Nel presente lavoro, la scienza di formulazione è stata proposta come un elemento chiave dello sviluppo di nuovi vaccini adatti alla consegna intradermica.