Leukemic cell/microenvironment interactions in Chronic Lymphocytic Leukemia: role of JAK/STAT axis in the survival of neoplastic clone

Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is characterized by the accumulation of mature clonal CD19+/CD5+/CD23+ B lymphocytes in peripheral blood, bone marrow, and lymphoid tissues. Despite their in vivo prolonged lifespan due to intrinsic defects, CLL leukemic cells rapidly undergo spontaneous apoptosis in vitro, highlighting the need of extrinsic signals delivered by the microenvironment. Several molecules, including those released by mesenchymal stromal cells (MSCs), signal through JAK (Janus kinases)-STAT (signal transducers and activators of transcription) pathways. During the PhD course, we particularly focused on JAK2/STAT3 axis since IL-6, one of the most abundant cytokines released in the CLL microenvironment, is the key ligand of the receptor triggering this pathway. The deregulation of JAK2/STAT3 axis may lead to aberrant activation of STAT3 and, as a result, to tumor development in hematopoietic cells. By western blotting, flow cytometry analysis, subcellular fractionation, and confocal microscopy, we analyzed 76 CLL patients and 23 healthy donors to investigate STAT3 involvement in CLL cell survival. We demonstrated that STAT3 expression was higher in malignant B cells (MFI: CLL cells 1.28±0.13 vs normals 0.61±0.09, Student’s t test, p<0.001) and the protein is significantly phosphorylated at Tyr705 compared with the normal counterpart (B lymphocytes from healthy donors) (MFI: CLL cells 211.3±35.85 vs normals 46.50±6.12, Student’s t test, p<0.05), thus showing its constitutive activation in CLL. Afterwards, we pointed out that the in vitro incubation of leukemic B cells with AG490 and Stattic, specific inhibitors of JAK2 and STAT3, respectively, induce a dose-dependent apoptosis of CLL B cells (e.g. Cell viability, 24h: CLL cells alone 62.90±4.24% vs CLL cells + AG490 50M 38.30±7.22%, Student’s t test, p<0.01; CLL cells alone 60.96±3.91% vs CLL cells + Stattic 10M 31.78±4.31%, Student’s t test, p<0.0001). Both AG490 and Stattic were able to bypass the microenvironmental protection when neoplastic B cells were co-cultured with MSCs (e.g. Cell viability, 48h: CLL cells 66.80±6.28% vs CLL cells + AG490 100M 22.50±7.50%, Student’s t test, p<0.01; CLL cells 57.51±4.95% vs CLL cells + Stattic 10M 26.25±5.45%, Student’s t test, p<0.001). In addition to JAK2/STAT3 inhibition, we showed that AG490 treatment on CLL cells can mediate other effects: i) it activates SHP-1, decreasing its phosphorylation at Ser591; ii) it inactivates protein Lyn, reducing the phosphorylation in its active site at Tyr396. Lyn, a Tyr-kinase, and SHP-1, a Tyr-phosphatase, are both involved in the prolonged lifespan of neoplastic CLL cells. In conclusion, the ability of AG490 and Stattic to induce apoptosis in leukemic B cells, bypassing the pro-survival stimuli provided by the tumor microenvironment, represents a starting point for the development of new therapeutic strategies in CLL, providing at the same time new insights on the cross-talk between JAK/STAT and BCR/Lyn axes in CLL cells.

La Leucemia Linfatica Cronica (LLC) è un disordine linfoproliferativo caratterizzato dall’accumulo di linfociti B maturi, con immunofenotipo CD19+/CD5+/CD23+, nel sangue periferico, in quello midollare e nei tessuti linfoidi. Nonostante le cellule leucemiche in vivo non vadano incontro ad apoptosi, se poste in vitro muoiono rapidamente; questo evidenzia l’importanza del microambiente nella sopravvivenza del clone neoplastico. Diverse molecole, incluse quelle rilasciate dalle cellule mesenchimali stromali (MSC) agiscono tramite la via di JAK (Janus Kinase)/STAT (Signal Transducer and Activators of Transcription). Nel corso del dottorato, ci siamo concentrati in particolare sull’asse JAK2/STAT3 in quanto IL-6, una delle citochine più abbondanti tra quelle presenti nel microambiente, è il ligando principale del recettore a monte di questa via. La deregolazione dell’asse JAK2/STAT3 può portare all’attivazione incontrollata di STAT3 e, conseguentemente, allo sviluppo di tumori delle cellule ematopoietiche Tramite western blotting, citometria a flusso, frazionamento subcellulare e microscopia confocale, abbiamo analizzato 76 pazienti con LLC e 23 donatori sani al fine di studiare il coinvolgimento di STAT3 nella sopravvivenza della cellula leucemica. Abbiamo dimostrato come l’espressione di STAT3 sia maggiore nelle cellule neoplastiche (MFI: cellule di LLC 1.28±0.13 vs normali 0.61±0.09, Student’s t test, p<0.001) e come sia significativamente fosforilata alla Tyr705 in confronto ai linfociti B di donatori sani (MFI: cellule di LLC 211.3±35.85 vs normali 46.50±6.12, Student’s t test, p<0.05), evidenziando così la sua attivazione costitutiva nella CLL. Dopo di ciò, abbiamo osservato come il trattamento in vitro di cellule leucemiche con AG490 e Stattic, rispettivamente inibitori specifici di JAK2 e di STAT3, induca apoptosi dose-dipendente nelle cellule B di LLC (es. Vitalità cellulare, 24h: cellule di LLC 62.90±4.24% vs cellule di LLC + AG490 50M 38.30±7.22%, Student’s t test, p<0.01; cellule di LLC 60.96±3.91% vs cellule di LLC + Stattic 10M 31.78±4.31%, Student’s t test, p<0.0001). Sia AG490 che Stattic si sono dimostrati capaci di superare la protezione fornita dal microambiente quando le cellule neoplastiche sono poste in cultura insieme alle MSC (es. Vitalità cellulare, 48h: cellule di LLC 66.80±6.28% vs cellule di LLC + AG490 100M 22.50±7.50%, Student’s t test, p<0.01; cellule di LLC 57.51±4.95% vs cellule di LLC + Stattic 10M 26.25±5.45%, Student’s t test, p<0.001). Abbiamo dimostrato come AG490 non sia solo in grado di inibire l’asse JAK2/STAT3, ma possa anche mediare altri effetti come: i) l’attivazione di SHP-1 diminuendo la sua fosforilazione in Ser591; ii) l’inibizione della proteina Lyn, riducendo la fosforilazione del sito attivo in Tyr396. Lyn, una tirosin-chinasi, e SHP-1, una tirosin-fosfatasi, sono coinvolte nella sopravvivenza delle cellule di LLC. In conclusione, la capacità di AG490 e Stattic di indurre apoptosi nelle cellule B leucemiche superando la protezione fornita dal microambiente, rappresenta un punto di partenza per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche nella LLC, fornendo allo stesso tempo nuove informazioni per la caratterizzazione del crosstalk tra l’asse JAK2/STAT3 e il pathway BCR/Lyn nelle cellule leucemiche.