Transcription factor IKAROS: from leukaemia genetics to lymphocyte development

Haematopoiesis is a cell differentiation process, starting from multipotent haematopoietic stem cells (HSC) to increasingly more fate-restricted blood cell progenitors. Each step during this process is strictly regulated by key transcription factors, activating or repressing stemness and lineage-specific genes. Not surprisingly, mutations or translocations involving transcription factors are often associated with leukaemia. IKAROS is the founding member of a zinc finger transcription factor family primarily involved in haematopoietic fate-decision. IKAROS protein is characterized by 2 domains: one at the N-terminus, with 4 zinc fingers, necessary for the DNA binding, and one at the C-terminus, with 2 zinc fingers, necessary for the homo- hetero-dimerization of the protein and its consequent activation. IKAROS is expressed in HSC and during lymphoid commitment expression increases, silencing stemness and myelo-erythroid priming genes and enhancing lymphoid specific factors. In Ikzf1-knockout mice models, lymphopoiesis is severely impaired, with a retardation of T cell development and a block in B, NK and dendritic cell differentiation due to a failure of HSC to differentiate into common lymphoid progenitors (CLP). Ikzf1 mutant mice developed T-cell leukaemia or lymphoma with a penetrance of ~95% within 6-8 weeks after birth, and died soon after. In human, IKZF1 alterations are rarely associated with T-cell leukaemias, but surprisingly IKZF1 deletions were found to occur in 15% of paediatric B cell precursors ALL (BCP-ALL) and in more than 70% of paediatric Philadelphia positive BCP-ALL. In this thesis, we evaluate the impact of IKAROS in paediatric leukaemia and during the B-cell lineage specification. In Chapter 3, we studied the incidence of IKZF1 point mutations and indels in a European cohort of Ph+ BCP-ALL paediatric patients. In particular, we screened, using next generation amplicon deep sequencing (NGS), the 7 coding exons of IKZF1 in 98 IKZF1 non deleted and 61 IKZF1 deleted patients. Seven missense point mutations and 7 frameshift small indels were identified in IKZF1-non deleted and 3 point mutations were detected in IKZF1-deleted patients, all of them with a predicted deleterious effect on IKAROS function. Mutations were mainly located in exons 5 and 8, encoding the DNA-binding and dimerization domains respectively. In IKZF1-non deleted patients, mutations seem to indicate the same prognosis as macrodeletions, with a higher incidence of adverse events in patients treated before TKI introduction compared to patients treated with a combination therapy including TKIs. Among the mutated patients identified in our mutation screening, one patient had the same single nucleotide deletion both at diagnosis and complete remission, suggesting a constitutional status of the mutation. In Chapter 4 we further investigated the constitutional status of the IKZF1 mutation in the proband and his family, finding in 3 generations the same mutation in the mother and 3 other carriers, as well as a second leukaemia case in the family that had occurred more than 45 years ago. The IKZF1 single nucleotide deletion gave rise to a truncated protein with loss of the last part of the DNA binding domain and the C-terminal dimerization domain, resulting in DNA-binding deficiency and a diffuse nuclear localization. The mutant allele was transcribed in proband’s bone marrow at complete remission, as well as in peripheral blood (PB) cells of his sister, an unaffected mutation carrier. Finally, the truncated protein was identified in the PB cells of the proband’s sister, in a lower amount compare to the wt-IKAROS isoforms. In Chapter 5, a model to study Ikaros-mediated gene expression regulation is described and characterized. Ikaros expression is enhanced during B-cell development, and pilots B cell-progenitors out of cell cycle allowing the Ig light chain recombination. To better comprehend the kinetics and mechanisms of Ikaros-gene expression regulation, we knocked-out endogenous Ikaros from a murine cycling preB cell line, using the CRISPR-Cas9 technique, and subsequently transduced cells with an inducible Ikaros cassette, that allowed to precisely regulating Ikaros translocation in the nuclei. Inducible Ikaros efficiently translocated to the nuclei and bound to target gene promoter, but its gene expression regulation appeared impaired. Indeed, inducible Ikaros was able to up-regulate well known target genes, but failed to down-regulate 3 selected target genes, know to be down-regulate after Ikaros induction in an endogenous Ikaros wt model. In Chapter 6 we took advantage of the Ikaros inducible system to study the metabolic changes that occur during B-cell lymphocyte development in a cycling to resting preB cell model. Three FRET-sensors specifically designed to evaluate the cellular levels of ATP, glucose and AMPK activation status were transduced in our cell model, and preliminary measurements were performed using at fluorescent microscopy and FACS after 16 hours of Ikaros induction

L’ematopoiesi è un processo differenziativo che, a partire da cellule staminali ematopoietiche multipotenti, da origine a tutte le cellule del sangue. Ogni step differenziativo durante questo processo è finemente regolato da un insieme di fattori di trascrizione che agiscono in concerto bloccando la trascrizione di geni legati alla staminalità ed attivando geni essenziali per la specificazione ed il differenziamento delle diverse linee maturative ematopoetiche: linfoide, mieloide, eritroide e magacariocitoide. Non è quindi sorprendente che mutazioni o traslocazioni che interessano questi fattori di trascrizione siano spesso associate con l’insorgenza di leucemie. IKAROS fa parte di una famiglia di fattori di trascrizione principalmente coinvolta nella specificazione in senso linfoide delle cellule ematopoietiche. IKAROS è caratterizzato da due domini funzionali: un dominio N-terminale, composto da 4 zinc-finger, necessario per il legame della proteina al DNA, ed un domino C-terminale, formato da 2 zinc-finger, indispensabile per la omo-etero-dimerizzazione della proteina e la sua conseguente attivazione. IKAROS è espresso a livello delle cellule staminali ematopoietiche, e la sua espressione aumenta durante il differenziamento linfoide, silenziando geni legati alla staminalità ed allo sviluppo eritro-mieloide e potenziando l’espressione di geni legati allo sviluppo linfoide. In topi knockout per il gene Ikzf1 la linfopoiesi è gravemente compromessa, con un ritardo nello sviluppo delle cellule T ed un completo blocco nel differenziamento dei linfociti B, cellule natural killer e delle cellule dendritiche. Questo fenotipo è dovuto all’incapacità delle cellule staminali ematopoietiche di differenziare in cellule progenitrici della linea linfoide in assenza di Ikaros. La mancanza di Ikaros in questi topi porta all’insorgenza di leucemie o linfomi a cellule T nel ~95% dei casi entro sei mesi dalla nascita. Nell’uomo, aberrazioni associate ad IKZF1 sono rare nelle leucemie T, ma, al contrario, delezioni di parte del gene sono presenti nel 15% delle leucemie pediatriche a fenotipo B (BCP-ALL), e la percentuale raggiunge circa il 70% se si considera un particolare sottogruppo caratterizzato dalla presenza del cromosoma aberrante Philadelphia. In questa tesi abbiamo studiato il ruolo di IKAROS nelle leucemie pediatriche e durante il differenziamento dei linfociti B. Nel terzo capitolo l’incidenza di mutazioni puntiformi e piccole inserzioni/delezioni (indel) del gene IKZF1 viene studiata in una coorte europea di pazienti pediatrici affetti da BCP-ALL con presenza del cromosoma Philadelphia. Grazie all’utilizzo del sequenziamento di nuova generazione abbiamo sequenziato i 7 esoni codificanti di IKZF1 in 98 pazienti IKZF1-non deleti ed in 61 pazienti IKZF1-deleti. Tra i 98 pazienti non deleti abbiamo riscontrato la presenza di 7 mutazioni puntiformi e 7 indel, mentre 3 mutazioni puntiformi sono state evidenziate nella coorte di pazienti IKZF1 deleti. Tutte le aberrazioni da noi trovate sono predette avere un effetto deleterio sulla funzionalità della proteina. Queste aberrazioni genetiche sono principalmente localizzate sul quinto e sull’ottavo esone, che codificano per i domini di legame al DNA e di dimerizzazione, rispettivamente. Nei pazienti che non presentavano macrodelezioni di IKZF1, le mutazioni da noi identificate sembrano avere lo stesso impatto prognostico delle macro-delezioni, presentando una maggior incidenza di eventi avversi nei pazienti trattati prima dell’introduzione degli inibitori di tirosin-chinasi rispetto a quelli a cui sono stati somministrati in sinergia con la chemioterapia. Un paziente mutato identificato durante il nostro screening ha mostrato la presenza della stessa delezione di un singolo nucleotide sia nel campione alla diagnosi che in quello in remissione, suggerendo una possible origine costituzionale della mutazione. Nel quarto capitolo è stata indagata la natura costituzionale della mutazione nel paziente e nella sua famiglia. La stessa delezione in eterozigosi è stata identificata nella madre del paziente ed in altri 3 portatori in 3 generazioni; abbiamo inoltre scoperto un secondo caso di leucemia pediatrica all’interno della famiglia verificatasi più di 45 anni fa. La delezione riscontrata nella famiglia dà origine ad una proteina tronca con la perdita della parte terminale del dominio di legame al DNA e la completa perdita del dominio di dimerizzazione al C-terminale. L’assenza di questi domini comporta una ridotta affinità di legame al DNA ed ad una localizzazione nucleare diffusa. L’mRNA dell’allele mutato è stato ritrovato nelle cellule del midollo osseo del paziente in remissione completa, così come in cellule mononucleate del sangue di una delle sorelle, anch’essa portatrice della delezione. Nelle medesime cellule è stata riscontrata anche la presenza della proteina tronca, seppur in minor quantità rispetto alle isoforme wt. Nel quinto capitolo viene descritto e caratterizzato un nuovo modello cellulare murino per lo studio della regolazione dell’espressione genica mediata da Ikaros. L’espressione di Ikaros aumenta durante il differenziamento dei linfociti B, ad è necessario per arrestare il ciclo cellulare di cellule B progenitrici permettendo il riarrangiamento della catena leggera delle immunoglobuline. Per meglio comprendere la cinetica ed il meccanismo con cui Ikaros media l’espressione genica, abbiamo creato una linea murina di cellule preB knockout per il gene Ikzf1 grazie alla tecnica di “gene editing” della CRISPR-Cas9, ed abbiamo quindi trasdotto queste cellule con una cassetta contenente un sistema inducibile di Ikaros, che ci permette di controllare la traslocazione di Ikaros dal citoplasma al nucleo. Ikaros-inducibile è in grado di traslocare efficacemente nel nucleo e di legarsi al promotore di un suo gene target molto noto, ma la sua abilità di regolare l’espressione genica appare parzialmente compromessa. Infatti, Ikaros-inducibile promuove l’aumento di espressione di alcuni suoi geni target, ma non è in grado di silenziare 3 geni da noi selezionati e noti per essere silenziati da Ikaros. Nel sesto capitolo abbiamo utilizzato il sistema di Ikaros-inducibile per studiare i cambiamenti metabolici che avvengono durante lo sviluppo dei linfociti B, utilizzando un modello cellulare murino di cellule preB. Tre sensori basati sulla tecnica FRET, per quantificare i livelli cellulari di ATP, glucosio e di attivazione della proteina AMPK, sono stati trasdotti nel nostro modello cellulare, e sono quindi state eseguiti esperimenti preliminari utilizzando tecniche di microscopia a fluorescenza e FACS dopo 16 ore di induzione