Towards the development of new strategies for targeted and controlled drug delivery

In this contribution the design and development on new approaches for targeted or controlled drug delivery is proposed. The selected starting material for the synthesis of these drug delivery systems (DDSs) was pullulan. Pullulan is a natural and linear polysaccharide that possesses excellent water solubility, biocompatibility and biodegradability. In virtues of the presence of multiple anchoring points along its chain, pullulan represents also an ideal carrier to build up colloidal drug delivery systems. Initially, pullulan oxidation was performed and deeply investigated as a convenient method for its functionalization. This strategy allowed the synthesis of a polymer therapeutic suitable for the treatment of the hepatocellular carcinoma (HCC). According to statistics, HCC is the third cause of cancer related death and the problems regarding its treatment are mainly caused by the considerable consequences of the first-pass effect and the lack of selectivity towards cancer cells. Thus, we aimed at developing a pullulan based DDS with higher selectivity for liver cancer cells. In literature a peptide sequence called preS121-47, portion of a protein located in the envelope of the Hepatitis B virus, was reported to be responsible for hepatocytes recognition, interaction and virus internalization. Moreover, the proposed receptor for this peptide, named SERPINB3, has been found overexpressed in HCC, thus representing a favourable target. Pullulan was modified with the introduction of seven peptide preS121-47 molecules and the selectivity towards cells overexpressing SERPINB3 (HepG2/SERPINB3) was proved to be 2 times higher when compared with both control cells not overexpressing SERPINB3 (HepG2/EMPTY) and control polymer without targeting agent. Then, the introduction of doxorubicin, linked to pullulan through an hydrazone pH-sensitive cleavable bond, lead to the formation of a complete polymer therapeutic which showed improved efficacy on hepatocellular carcinoma cells. Intending to explore other protocols for pullulan functionalization, its activation with p-toluenesulfonyl chloride and subsequent substitution with propargylammine was carried out. The display of alkyl groups along the polysaccharide chain permits the introduction of linking groups through copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry reaction (CuAAC). Two rhodamine labelled polymers containing labile linking groups, i.e. hydrazone and ester, were synthesized. The stability of these conjugates in response to the pH was tested in comparison with a control polymers including only covalent bonds. Pullulan functionalized with the ester bond showed less stability that what expected, while sufficient retention of rhodamine, used as fluorescent drug model, was observed for the hydrazone bond. The potential use of these products as carrier for the sustained drug release in the vitreous of the eye was then evaluated. The flexible and highly biocompatible pullulan-based products demonstrated ex vivo to move slowly into the vitreous of an intact porcine eye. In vitro tests confirmed the safeness and high internalization levels of such bioconjugates on retina epithelium cells (ARPE-19). Furthermore, considering the peculiar features of the anatomy of the eye, we hypothesized to investigate the potential use of cell penetrating enhancer (CPE) decorated liposomes for improved entrance to the retinal cells after the administration through intravitreal injection. Taking advantage of the expertize on polysaccharide functionalization, the synthesis of an innovative CPE molecule starting from a maltotriose core was accomplished in our laboratory. This non-peptidic and polycationic TAT-like system was used in the present work for the decoration of liposomes. Different combinations of TAT and PEG2kDa-DSPE were evaluated and tested, but the formulation containing equal amount of these two decorating agents showed the most favourable characteristic for ophthalmic applications. Indeed, the diffusion coefficient calculation performed ex vivo on porcine eyes highlighted the possibility to tune liposomes mobility in vitreous by tuning their superficial properties. The surface decoration of liposomes with PEG2kDa-DSPE endowed liposomes with slipping properties, improving their vitreous mobility, while the presence of TAT molecule conferred enhanced uptake and penetration ability towards retina cells. Indeed, in vitro cell studies on ARPE-19 confirmed the low toxic effects and excellent level of uptake achieved with the co-decoration with PEG and TAT.

La tecnologia farmaceutica negli ultimi decenni si è indirizzata in maniera sempre più consistente verso lo sviluppo di nuovi sistemi in grado di ovviare ai limiti delle convenzionali terapie. La maggior parte delle molecole ad azione terapeutica possiede, infatti, alcuni ostacoli all’ampio utilizzo, come la scarsa solubilità in acqua, un profilo farmacocinetico inadeguato e la mancata selettività per l’organo bersaglio. Pertanto, lo sviluppo di metodologie che consentano un direzionamento sito-specifico e controllato di farmaci può essere di fondamentale aiuto non solo per l’ottimizzazione della terapia ma anche per il miglioramento della qualità della vita del paziente. In quest’ottica, il presente progetto di ricerca si è focalizzato nello sviluppo di sistemi a base polisaccaridica per il rilascio direzionato e controllato di farmaci. I polisaccaridi costituiscono infatti una piattaforma ideale per la sintesi di sistemi di drug delivery grazie alla loro notevole solubilità in acqua, biocompatibilità e biodegradabilità. Inoltre, possiedono diversi punti di ancoraggio per il legame con farmaci, agenti direzionanti o sonde fluorescenti. Il pullulano è stato scelto come polisaccaride modello per lo studio delle metodiche di funzionalizzazione e lo sviluppo di carrier polimerici. L’unità ripetitiva del pullulano è il maltotriosio, formato da tre molecole di glucosio legate da legami α(1-4) glicosidici. Ciascuna unità di maltotriosio è invece legata alla successiva attraverso un legame α(1-6) glicosidico. Questa peculiare copresenza di legami α(1-4) e α(1-6) conferisce al pullulano una struttura lineare e flessibile, adatta alla funzionalizzazione. Inizialmente il pullulano è stato ossidato utilizzando il periodato di sodio. Questo ossidante è selettivo per i dioli vicinali e permette l’apertura dell’anello piranosico e la formazione di due gruppi aldeidici. Questi gruppi aldeidici possono successivamente reagire con un gruppo amminico attraverso la reazione di amminazione riduttiva. Si ottiene in questo modo una base di Schiff che può essere ridotta con l’utilizzo di agenti riducenti quali cianoboroidruro di sodio e il boroidruro di sodio. Quello che si forma nel passaggio finale è pertanto un legame amminico stabile. L’ossidazione del pullulano è stata inizialmente sfruttata per il legame con una sonda fluorescente scelta come modello tra una libreria di composti sintetizzati presso il laboratorio della Prof.ssa Maria Grazia Ferlin dell’Università di Padova (Dip. di Scienze del Farmaco). La sintesi del coniugato fluorescente Pull-38 è stata di valido aiuto nello studio delle proprietà spettrofotometriche e spettrofluorimetriche della sonda. Infatti, attraverso tecniche spettrofluorimetriche, microscopia confocale e studi di tossicità e uptake in vitro, è stato possibile valutare il potenziale di tali composti nell’ambito della biologia cellulare. Successivamente, la stessa tecnica di coniugazione ha permesso la sintesi di un coniugato per il direzionamento sito-selettivo al carcinoma epatocellulare (HCC). In questo studio il pullulano è stato funzionalizzato con l’agente di targeting preS121-47 e con la rodamina come agente fluorescente. E’ riportato in letteratura che il peptide preS121-47, porzione della proteina preS1 presente nel capside del virus dell’epatite B, possiede un ruolo fondamentale nell’interazione del virus con la cellula epatica e nella sua internalizzazione. Il recettore di tale peptide è indicato con il nome di SERPINB3. La caratterizzazione del coniugato ha evidenziato il legame di sette molecole di peptide per catena di pullulano, con conseguente formazione di strutture a grappolo della dimensione di circa 150 nm. In collaborazione con il gruppo della Prof.ssa Patrizia Pontisso dell’Università di Padova (Dip. di Medicina) si è testata l’effettiva selettività del coniugato per le cellule sovra-esprimenti SERPINB3. L’uptake in tali cellule è risultato 2.5 volte maggiore rispetto a quello ottenuto nei normali epatociti. Il sistema è stato poi implementato con l’introduzione di doxorubicina, farmaco scelto come modello. E stato introdotto un legame idrazonico acido labile tra il backbone polimerico e il farmaco per garantire il rilascio di doxorubicina all’interno dell’endosoma. Si è dimostrato con le analisi al DLS e le immagini al TEM che i coniugati contenenti doxorubicina auto-assemblano a costituire strutture sferiche della dimensione di circa 170 nm. L’efficacia di tale coniugato si è rivelata doppia sia rispetto al pullulano controllo privo di preS121-47 che alle cellule controllo non esprimenti SERPINB3. In una seconda fase del progetto il pullulano è stato attivato con p-toluene cloruro di solfonile e successivamente sostituito con propargilammina. L’introduzione del propargile ha permesso quindi la funzionalizzazione del carrier attraverso la reazione di click chemistry tra un gruppo azidico e un alchino. Sono stati sintetizzati in questo modo tre diversi coniugati di pullulano marcato con rodamina. La rodamina è stata legata al polimero attraverso un legame idrazonico e un legame estereo. E’ stata poi valutata la stabilità di tali legami alla variazione di pH, ponendoli a confronto con un coniugato controllo pullulano-rodamina contenente solo legami covalenti. Tali coniugati polisaccaridici sono quindi stati testati in collaborazione con il gruppo del Prof. Arto Urtti dell’Università di Helsinki durante i sei mesi trascorsi presso il suo laboratorio (Centre for Drug Research, Faculty of Pharmacy, Helsinki). L’obiettivo di tali polimeri è quello, attraverso la somministrazione intravitreo, di garantire un rilascio sostenuto di farmaco per il trattamento di patologie della parte posteriore dell’occhio, quali la degenerazione della macula o la retinopatia diabetica. La mobilità di tali coniugati è stata valutata ex vivo nell’occhio intatto di maiale attraverso microscopia confocale dimostrando che essi vengono trattenuti nel reticolo del vitreo grazie alla natura polisaccaridica e flessibile del pullulano. I test di tossicità realizzati in vitro su cellule di epitelio di retina hanno confermato l’alta tollerabilità dei coniugati sintetizzati. Infine, gli studi di uptake condotti con l’utilizzo del citofluorimetro e del microscopio confocale hanno rivelato l’alto livello di internalizzazione dei prodotti, confermando l’effettiva possibilità di sviluppo di futuri carrier a base di pullulano per l’applicazione oculare. Infine, l’esperienza nella modifica di polisaccaridi maturata nel nostro laboratorio di ricerca ha permesso lo sviluppo di un innovativo cell penetrating enhancer (CPE) a partire da un core maltotriosidico. Questa nuova molecola di natura non peptidica e poli-argininica (TAT) è stata utilizzata per la decorazione di liposomi utilizzabili nel delivery oculare. Diverse formulazioni di liposomi decorati superficialmente con PEG2kDa-DSPE e TAT sono state prese in considerazione e studiate presso l’Università di Helsinki durante i mesi trascorsi nel laboratorio del Prof. Arto Urtti. E’ stato verificato attraverso studi ex vivo che liposomi cationici (TL) decorati in superficie con solo TAT sono incapaci di muoversi nel vitreo e rimangono intrappolati a causa delle interazioni elettrostatiche che si sviluppano con i componenti anionici dell’umor vitreo, come l’acido ialuronico e il solfato di condroitina. Al contrario, l’aggiunta di PEG aumenta la mobilità dei liposomi conferendogli la capacità di “scivolare” e penetrare attraverso le maglie dell’umor vitreo. I test di tossicità condotti in vitro con l’utilizzo delle cellule ARPE-19 hanno rivelato che nonostante i liposomi cationici siano tossici per le cellule, tale tossicità sia notevolmente ridotta in presenza PEG. I liposomi sono stati poi caricati con calceina per mimare la presenza di un farmaco idrofobico e valutarne l’uptake. Si è misurato un eccezionale livello di internalizzazione nelle ARPE-19 per i liposomi decorati con il TAT o con TAT e PEG rispetto ai liposomi privi di cell penetrating enhancer. Pertanto, i liposomi sia PEGylati che decorati in superficie con il TAT si sono dimostrati la miglior formulazione testata per l’adeguata mobilità nel vitreo, la ridotta tossicità e l’elevato uptake sulle cellule di retina.