ARRAY-CGH COME ESAME DI PRIMO LIVELLO NELLA DIAGNOSI MOLECOLARE DI RITARDO MENTALE E ANOMALIE CONGENITE

The array-CGH technique has emerged in recent years as a powerful tool for the identification of molecular causes underlying complex phenotypes characterized by intellectual disability, autism, epilepsy, psychiatric disorders and multiple congenital anomalies. Over the past 10 years, it has become clear that the conventional cytogenetic analysis is unable to detect rearrangements less than 5-10Mb which can be responsible for these clinical phenotypes. This limit has been exceeded with array-CGH technique which has increased by 15-20% the detection rate of cryptic chromosomal imbalances (deletions or duplications). The possibility to have a genome wide technique with a high resolution led to the proposal, in 2010, by the International Standard Cytogenomic Array (ISCA) Consortium, to use this technique as the first-line test in individuals with intellectual disabilities and congenital anomalies. From studies with microarray technology it has become clear that there are chromosomal regions in which aberrant recombination are particularly frequent, due to the presence of segments with elevated sequence homology, that cause a high degree of genomic instability. Moreover the use of the array-CGH showed the presence in the genome of a large number of structural variations, larger than 1Kb, defined copy number variation or CNVs, that does not always represent a direct cause of disease because they have also been identified in healthy individuals. This complexity in the interpretation of pathogenic CNVs is even more relevant in prenatal diagnosis because it leads to uncertainty in terms of prognosis for the fetal health. For this reason, despite the advantages of the technique, the array-CGH analysis in prenatal diagnosis is considered as a second-line test to be used in association to conventional cytogenetics analysis. In this study were evaluated with array-CGH analysis, 1051 patients with mental and / or developmental disabilities, autism, multiple congenital anomalies and dimorphisms. The main purpose was to verify the presence of cryptic chromosomal rearrangements in order to demonstrate the utility of genomic microarray as first-line test for the characterization of the molecular causes underlying the phenotype of individuals. Then the mechanisms of formation of anomalies were hypothesized by the analysis of the breakpoints, to verify the presence of regions of homology that may have predisposed to the rearrangement. So it was examined whether the mechanism of formation and the clinical significance of the identified CNVs could be related to the pattern of inheritance, the type or the size of the imbalance. The results show that 15.8% of the patients has at least one pathological anomaly or VOUS (variant of uncertain significance) that is likely pathological, and that these are more frequently deletions and CNVs arisen de novo. It was also highlighted that both the clinical significance of CNVs and their mechanism of formation may be related to the size of the imbalance. It was later analyzed the distribution of CNVs in different chromosomes and it was found that in some of them the density of anomalies is greater than the others. The application of the array-CGH in a high number of patients has also allowed to estimate the sensitivity to detect mosaicism, although they have a frequency less than 1% in individuals with learning disabilities. It was observed that the technique is able to detect anomalies present in up to 10% of cells. Finally some fetal samples of chorionic villi and amniotic fluid were analyzed to evaluate the possible use of genomic microarray in prenatal diagnosis. The small number of analyzed samples did not allow us to draw conclusions, but the difficulties in the interpretation of the clinical significance of CNVs, make it a second-line test to be used in association with standard karyotype.

La tecnica di array-CGH si è affermata negli ultimi anni come un potente strumento per l’identificazione delle cause molecolari alla base di fenotipi complessi caratterizzati da disabilità intellettive, autismo, epilessia, disordini psichiatrici e anomalie congenite multiple. Negli ultimi 10 anni, infatti, è emerso sempre più chiaramente che l’analisi citogenetica convenzionale non è in grado di rilevare riarrangiamenti inferiori alle 5-10 Mb che possono essere responsabili di tali fenotipi clinici. Questo limite è stato superato dall’array-CGH che ha aumentato del 15-20% la detection rate di sbilanciamenti cromosomici criptici (delezioni o duplicazioni). La possibilità di avere una tecnica di tipo genome wide ad elevata risoluzione ha portato alla proposta, nel 2010, da parte dell’International Standard Cytogenomic Array (ISCA) Consortium, dell’utilizzo di tale tecnica come esame di primo livello in individui con disabilità intellettive e anomalie congenite. Dagli studi effettuati con tecnologia microarray è risultato evidente che esistono regioni cromosomiche in cui sono particolarmente frequenti ricombinazioni aberranti, dovute alla presenza di segmenti con un’elevata omologia di sequenza che causano un alto grado di instabilità genomica. L’utilizzo dell’array-CGH ha inoltre rivelato la presenza nel genoma di un elevato numero di variazioni strutturali, di dimensioni maggiori di 1Kb, chiamate copy number variations (CNVs), le quali, essendo state identificate anche in individui sani, non sempre rappresentano una causa diretta di malattia. Questa difficoltà nell’interpretazione della patogenicità delle CNVs è ancora più rilevante in diagnosi prenatale poiché si traduce in una incertezza in termini prognostici sulla salute del feto. Per questo motivo, nonostante i vantaggi dati dalla tecnica, l’array-CGH in diagnosi prenatale viene, al momento, considerato un test di secondo livello da utilizzare in associazione all’analisi citogenetica convenzionale. In questo studio sono stati valutati, mediante array-CGH, 1051 pazienti che presentano ritardo mentale e/o dello sviluppo, autismo, anomalie congenite multiple e dimorfismi. L’obiettivo principale è stato quello di verificare la presenza di riarrangiamenti cromosomici criptici in modo da dimostrare l’utilità dell’impiego di microarray genomici come esame di primo livello per la caratterizzazione delle cause molecolari alla base del fenotipo patologico degli individui. Sono stati poi ipotizzati i meccanismi di formazione delle anomalie verificando, mediante l’analisi dei breakpoints, la presenza di regioni di omologia che possano aver predisposto al riarrangiamento. Quindi è stato valutato se il meccanismo di formazione e il significato clinico delle CNVs identificate possano essere correlati al pattern di ereditarietà, al tipo o alle dimensioni dello sbilanciamento. I risultati ottenuti mostrano che il 15.8% dei casi analizzati è portatore di una anomalia patologica o VOUS (variant of uncertain significance) verosimilmente patologica, e che queste sono più frequentemente delezioni e CNVs insorte de novo. È stato inoltre evidenziato che sia il significato clinico delle CNVs sia il loro meccanismo di formazione possano essere correlati alle dimensioni degli sbilanciamenti. È stata successivamente analizzata la distribuzione delle CNVs nei diversi cromosomi ed è emerso che in alcuni di essi la densità di anomalie riscontrate è maggiore rispetto agli altri. L’applicazione dell’array-CGH in un elevato numero di pazienti ha permesso, inoltre, di stimarne la sensibilità nell’identificazione di mosaicismi, sebbene abbiano una frequenza inferiore all’1% in individui con disabilità intellettive. È stato osservato che la tecnica è in grado di rilevare anomalie che coinvolgono anche un numero limitato di cellule, fino al 10%. Infine sono stati analizzati alcuni campioni fetali di villi coriali e liquido amniotico per valutare il possibile utilizzo dei microarray genomici in diagnosi prenatale. Il numero esiguo di campioni analizzati non ci ha permesso di trarre delle conclusioni, tuttavia, per le difficoltà che si riscontrano nell’interpretazione del significato clinico delle CNVs, è da ritenere al momento un test di secondo livello da utilizzare in associazione al cariotipo standard.