Toll2 signalling safeguards Enteric Nervous System integrity in Drosophila melanogaster

ABSTRACT Scientific and clinical investigations have recognized the gut microbiota as an essential super organism responsible for maintaining health. Accumulating evidences indicate that changes in the composition of the gut microbial community are involved in the pathophysiology of several disorders including Inflammatory Bowel Disease (IBD), though the cellular population and the underlying molecular mechanism are still uncertain. Intestinal microorganism interact with microbial sensors (i.e.TLR) strategically located in the gut mucosa to generate signaling crucial in preserving epithelial barrier integrity and local immune homeostasis. Therefore, the disruption of gut-microbiota derived signals secondary to dysbiosis or polymorphisms in microbial sensors (i.e. TLR2 and TLR4) may cause anomalies in the enteric nervous system, the neuronal network distributed through the gut wall. Since ENS maintains intestinal epithelial barrier integrity and mucosal immune homeostasis by integrating different functions, failure to provide the right signals from the gut microbiota might predispose to intestinal functional or inflammatory disorders. Therefore, this project aim to identify the molecular and cellular mechanism of gut microbiota- innate immunity – ENS axis using the genetically-tractable model organism Drosophila melanogaster. The Drosophila melanogaster is an ideal model because is easy and inexpensive to maintain, is ethically ideal for this project taking into account the high degree of conservation from an anatomical point of view and from innate immunity pathways. To study the role of toll signaling in the integrity of ENS we used the UAS-GAL4 system to induce tissue specific gene silencing. Thus, we have crossed a driver line which expresses the GAL4 protein under the control of ubiquitous (such as tubulin or actin) or cell specific (elav for neurons or mef for smooth muscle cells) promoters with a line UAS which carries a transgene that in this case is a specific siRNA sequence for toll. The GAL4 system can be temperature and chemically (RU486) inducible. In flies carrying ubiquitous, temperature inducible, toll2 silencing a significant loss of HRP+ neurons was detected. Moreover, also in flies with muscle cells and glia specific toll2 silencing we observed a dramatic loss of HRP+ neuronal bodies. Flies carrying both ubiquitous and cell specific toll2 silencing showed an increased survival as compared to w1118control flies. In presence of a gastrointestinal irritant, sodium dextran sulfate (DSS), we observed a reduced, as compare to control Wiii8, survival in flies carrying an ubiquitous toll2 silencing but not in flies with cell specific toll2 silencing. Since loss of toll2 signaling following ubiquitous or cell specific silencing caused a significant loss of neurons, we performed a DNA microarray gene expression analysis, in the gut of act Gal4 UAS-toll2, elav Gal4 UAS-toll2, mef Gal4 UAS-toll2 and w1118 control flies, to identify the downstream genes modulated by toll2 signaling involved in neuronal development and/or survival. We have identified several genes involved in the notch pathways, implicated in the formation of nervous system as well as in neuronal differentiation and development further supporting the view that toll2-derived signals are required to support enteric neurons integrity. To exclude temperature dependent effects we switched to UAS GAL4 system chemically inducible by the molecule RU586. By using ubiquitous drivers we obtained an effective toll2 silencing in act Gal4 UAS-toll2 flies associated to a significant loss of HRP+ neurons. Indeed, using cell specific drivers toll2 silencing was observed in mef Gal4 UAS-toll2 but not elav GAL4 UAS-toll2. Accordingly, toll2 silencing was associated to significant neuronal loss in mef Gal4 UAS-toll2 flies. Moreover, ubiquitous toll2 silencing using RU586 sensitive GAL4 drivers showed a dramatic reduction in survival following DSS exposure as compared to w1118 control flies. In conclusion, using the Drosophila melanogaster model we have shown that toll2-derived signals are required to support neuronal integrity in the gut and smooth muscle cells seem the most relevant sources of survival signals for neurons. These initial studies confirm the feasibility of this model to study the innate immunity- enteric nerves interplay to dissect complex molecular pathways relevant in pathologies characterized by a dysfunction of the enteric nerves.

ABSTRACT Studi scientifici e clinici hanno riconosciuto il microbiota intestinale come un organismo essenziale super-responsabile per il mantenimento della salute. Evidenze accumulate indicano che i cambiamenti nella composizione della comunità microbica intestinale sono coinvolti nella fisiopatologia di diverse malattie, tra cui malattia infiammatoria intestinale (IBD), anche se la popolazione cellulare e il meccanismo molecolare alla base sono ancora incerte. Il microrganismo intestinale interagisce con sensori microbici (ieTLR) in posizione strategica nella mucosa intestinale per generare una segnalazione cruciale nel preservare l'integrità della barriera epiteliale e omeostasi immunitaria locale. Pertanto, l'interruzione del microbiota intestinale e dei segnali derivati secondari di disbiosi o polimorfismi nei sensori microbici (es TLR2 e TLR4) può causare anomalie del sistema nervoso enterico, la rete neuronale distribuiti attraverso la parete intestinale. Poiché il SNE mantiene l'integrità della barriera epiteliale intestinale e l’omeostasi della mucosa immunitaria integrando diverse funzioni, il mancato conferimento dei giusti segnali dalla flora intestinale potrebbe predisporre a disturbi intestinali funzionali o infiammatori. Pertanto, questo progetto mira a identificare il meccanismo molecolare e cellulare dell’asse microbiota intestinale- immunità innata - SNE utilizzando l’organismo modello geneticamente trattabile Drosophila melanogaster. La Drosophila melanogaster è un modello ideale, perché è facile e poco costoso da mantenere, è eticamente ideale per questo progetto, tenendo conto l'elevato grado di conservazione da un punto di vista anatomico e dalle vie dell'immunità innata. Per studiare il ruolo della segnalazione nell'integrità dell'SNE abbiamo usato il sistema UAS-GAL4 per indurre il silenziamento genico tessuto specifico. Così, abbiamo usato una linea driver che esprime la proteina GAL4 sotto il controllo ubiquitario (come tubulina o actina) o cellulo specifico (elav per neuroni o mef per le cellule muscolari lisce) di un promotore con una linea UAS che porta un transgene specifico che in questo caso è una sequenza siRNA per toll. Il sistema GAL4 può essere temperatura e chimicamente (RU486) inducibile. In Drosophile conil toll2 silenziato in maniera ubiquitaria, temperatura inducibile, è stato rilevata una significativa perdita di neuroni HRP +. Inoltre, anche in Drosophile con silenziamento specifico del toll2 in cellule muscolari e cellule gliali abbiamo osservato una drammatica perdita di corpi neuronali HRP +. Le Drosophile con silenziamento delo toll2 sia ubiquitario che cellulo specifico, hanno mostrato un aumento della sopravvivenza rispetto alla linea controllo w1118. In presenza di una sostanza irritante gastrointestinale, destrano solfato di sodio (DSS), abbiamo osservato una ridotta sopravvivenza nei silenziati ubiquitari toll2, rispetto alla linea controllo w1118. Dal momento che la perdita di segnale toll2 sia a livello ubiquitario che cellulo specifico ha causato una significativa perdita di neuroni, abbiamo effettuato una analisi del DNA espressione genica microarray, nell'intestino di actina GAL4 UAS-toll2, elav GAL4 UAS-toll2, mef GAL4 UAS-toll2 e la linea di controllo w1118, per identificare i geni a valle modulati dal segnale del toll2 coinvolti nello sviluppo neuronale e / o la sopravvivenza. Abbiamo identificato diversi geni coinvolti nelle vie notch, implicate nella formazione del sistema nervoso e nella differenziazione e sviluppo neuronale sostenendo ulteriormente l'opinione che i segnali toll2 di derivazione sono necessarie per supportare l’integrità neuronale enterica. Per escludere effetti dipendenti della temperatura siamo passati al sistema UAS GAL4 chimicamente inducibile dalla molecola RU586. Utilizzando i driver ubiquiitari abbiamo ottenuto un efficace silenziamento del toll2 in silenziati ubiquitari, associato a una significativa perdita di neuroni HRP +. Infatti, utilizzando driver cellulo specifici il silenziamento del toll2 è stato osservato nei mef GAL4 UAS-toll2 ma non negli elav GAL4 UAS-toll2. Di conseguenza, il silenziamento del toll2 è stato associato a una significativa perdita neuronale nella linea mef GAL4 UAS-toll2. Inoltre, il silenziamento ubiquitario toll2 utilizzando i driver GAL4 sensibili RU586 ha mostrato una drastica riduzione della sopravvivenza a seguito di esposizione DSS rispetto alla mosche di controllo w1118. In conclusione, utilizzando il modello di Drosophila melanogaster abbiamo dimostrato che i segnali toll2-derivati sono tenuti a sostenere l'integrità neuronale nell'intestino e cellule muscolari lisce sembrano più rilevanti fonti di segnali di sopravvivenza per i neuroni. Questi studi iniziali confermano la fattibilità di questo modello per studiare l’interazione innata immunità-nervi enterici e sezionare percorsi molecolari complessi relativi a patologie caratterizzate da una disfunzione dei nervi enterici.