Technologies to study the mechanosensitive response of cardiovascular cell cultures

The ability to obtain induced pluripotent stem cells starting from adult differentiated cells, discovered in 2006 by Yamanaka, opened new fascinating opportunities for the study of the development of tissues and organs and for the establishment of new therapeutic approaches. To fully take advantage of pluripotent stem cells potentiality for scientific and clinical research, it’s necessary to develop also new technologies that will enable the reproduction in vitro of the in vivo environment. In the last decade, it was discovered that the mechanical microenvironment has a very marked impact on virtually all cellular processes, ranging fro morphology to gene expression and faith specification. Mechanotransduction, which is the biological process that enable cells to sense and respond to mechanical stimuli, is present in all cells, however it is believed that it may have greater influence in tissues that are subjected to higher mechanical stimuli in vivo, as in the case of the cardiovascular system. As an example, it has been shown that mechanical cues strongly affect the development and maturation of cardiovascular tissues, and that abnormal mechanotransduction can be linked to the onset of several cardiovascular diseases. There is a great interest in the scientific and clinical research communities on the study of the cardiovascular system since cardiovascular diseases are the principal cause of death worldwide and also the associated health care costs to prevent and treat these pathologies are quite elevated. Moreover, cardiovascular toxicity is the primary cause of drug withdrawal, so the development of novel, more accurate models of the cardiovascular system are extremely important also for pharmaceutical research and development. The aim of this work is to develop innovative technologies to reproduce in vitro the in vivo mechanical microenvironment, specifically that of the cardiovascular system, to gather further knowledge on the biological response to mechanical cues. In particular, these newly developed technologies could be used to reproduce the mechanical stimuli exerted on the cardiovascular system by physical strain, such as agonistic motorcycle driving. Specifically, in this thesis the focus was on reproducing the characteristic morphology of cardiovascular tissues’ cells and on mimicking mechanical strains typical of the cardiovascular system. Firstly, the polarization typical of cardiac muscle cells has been reproduced on glass, outilining and optimizing strategies to obtain aligned cardiomyocytes. The alignment is imposed creating a linear pattern of cell repulsive stripes, made of polyacrylamide hydrogels, alternated with protein-coated cell adhesive stripes. The establishment of a robust and precise glass patterning technique during this work will allow to study in depth the effect of topology and polarization on cellular gene expression and also will enable the study of cardiomyocytes intercalated discs’ morphology and the transmission of electrical signals among neighboring cells. Later on, the patterning techniques were transferred to elastomeric materials, such as PDMS, to perform mechanical stimulation of aligned cardiomyocytes cultures, reenacting the organ and tissues environment. The first stretching device realized was designed to perform biological assays that require an elevated quantity of starting material, such as protein, DNA or RNA extractions. For this reason the culturing area is 9cm2, and mechanical deformation is imposed through the mechanical traction generated by the ElectroForce® planar biaxial TestBench (Bose). In this device, cell alignment is obtained through physical pattering, which means the creation of PDMS channels of different heights along which the cells are seeded. The second stretching device realized during this work was designed mainly for imaging analysis, such as immunofluorescence, and patch clamp. The culturing area is 1cm2, and mechanical deformation is generated inflating a PDMS membrane in specifically designed rectangular areas that constitute about 40% of the total culturing area. In this case, cell alignment is performed realizing cell repellent polyacrylamide stripes, harnessing the same scientific principle used for glass patterning. Both culturing device were tested to verify their biocompatibility and ensure that the mechanical stimuli they can impose are sufficient to trigger a biological response.

La possibilità di riprogrammare le cellule adulte in cellule pluripotenti indotte, scoperta nel 2006 da Yamanaka, ha aperto nuove allettanti prospettive sia per lo studio dei processi di differenziamento che portano allo sviluppo di organi e tessuti, sia per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Per poter sfruttare a pieno le potenzialità nel campo della ricerca scientifica e medica delle cellule staminali indotte, è tuttavia necessario sviluppare tecnologie innovative che permettano di ricreare in vitro le caratteristiche riscontrate in vivo. In particolare nell’ultimo decennio è stato scoperto che il microambiente meccanico esercita una notevole influenza sui processi cellulari, regolando la morfologia, l’espressione genica e il differenziamento delle cellule stesse. Nonostante la meccanotrasduzione, ovvero il processo secondo cui gli stimoli meccanici esterni vengono tradotti dalle cellule in processi biologici, sia presente in tutte le cellule, si ritiene che possa avere particolare rilevanza nei tessuti che in vivo sono sottoposti a maggiori stimoli meccanici. In particolare, si è visto come gli stimoli meccanici esercitino una notevole influenza nello sviluppo e maturazione dei tessuti del sistema cardiovascolare e come stress meccanici anomali possano essere correlati all’insorgenza di patologie cardiovascolari. Il sistema cardiovascolare riveste un particolare interesse nel mondo scientifico e clinico in quanto le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte al mondo, e anche i costi associati alla prevenzione e al trattamento di tali patologie sono particolarmente rilevanti. Per giunta, la cardio-tossicità è la principale causa di rigetto dei nuovi farmaci, rendendo lo studio del sistema cardiocircolatorio estremamente rilevante anche nella fase di sviluppo farmaceutico. Lo scopo di questo lavoro è sviluppare nuove tecnologie atte a riprodurre in vitro il microambiente meccanico presente in vivo, con particolare riferimento al sistema cardiovascolare, per consentire lo studio della risposta cellulare agli stimoli meccanici. Nello specifico, le tecnologie sviluppate potranno essere usate per riprodurre gli stimoli a cui il sistema cardiovascolare è sottoposto durante sforzi intensi, come ad esempio la guida agonistica di motocicli. In particolare è stato posta l’attenzione alla riproduzione della morfologia delle cellule del tessuto cardiaco e delle deformazioni meccaniche tipiche del sistema cardiovascolare. In primo luogo, per riprodurre la polarizzazione tipica delle cellule del muscolo cardiaco, sono state delineate o ottimizzate strategie per ottenere colture allineate di cardiomiociti su vetro. L’allineamento viene ottenuto creando linee di esclusione cellulare costituite da un gel di poliacrilamide, alternate a linee in cui l’adesione cellulare viene favorita mediante trattamento con proteine della matrice extracellulare. Lo sviluppo di un metodo robusto e preciso per la realizzazione di colture di cardiomiociti allineati permetterà lo studio dell’effetto della topologia e polarizzazione sull’espressione genica delle cellule, e inoltre permetterà di analizzare la morfologia delle giunzioni cardiache e la trasmissione degli impulsi elettrici tra cellule adiacenti. Successivamente le tecniche di allineamento sono state trasferite anche ai materiali materiali elastomerici, come il PDMS, per permettere la sollecitazione meccanica di colture allineate, similmente a quanto avviene negli organi. Il primo sistema di stretch meccanico è stato sviluppato per effettuare analisi di estrazione di proteine, RNA o DNA. È costituito da una camera di coltura di 9cm2 e la stimolazione avviene attraverso la trazione meccanica esercitata da ElectroForce® planar biaxial TestBench (Bose), in questo caso l’allineamento cellulare viene imposto tramite la realizzazione sulla superficie di coltura di canali a differente altezza su cui si dispongono le cellule. Il secondo sistema di stretch è stato sviluppato principalmente per effettuare analisi di imaging, come immuofluorescenze, e di patch clamp. La camera di coltura è pari a 1cm2 e la stimolazione meccanica avviene gonfiando una membrana in apposite aree rettangolari di deformazione, che costituiscono circa il 40% della totale area di coltura. In questo caso l’allineamento cellulare viene imposto tramite la realizzazione di righe cellule-repellenti in poliacrilamide, sfruttando lo stesso principio adottato nel caso del vetro. Entrambi i sistemi di coltura sono stati testati per dimostrarne le biocompatibilità e per verificare che gli stimoli meccanici che sviluppati sono tali da innescare una risposta cellulare.