Cross-reactivity of anti-Ro52 antibodies and genetic susceptibility in congenital heart block

Introduction. Congenital heart block (CHB) is a passively acquired autoimmune disease associated with transplacental transfer of maternal anti-Ro/SSA and/or anti-La/SSB antibodies mediating inflammation and subsequent fibrosis of the atrio-ventricular node in the fetal heart. Despite the long-established association of maternal antibodies in directly inducing CHB both with in vitro and in vivo studies, the pathogenic mechanisms involved remain unclear and identification of cross-reactive targets of anti-Ro52 antibodies in the fetal heart is matter of debate. CHB occurs in 1–2% of anti-Ro/SSA antibody-positive pregnancies and has a recurrence rate of 12–20% in a subsequent pregnancy, suggesting that additional factors, such as genetic and environmental components may determine the outcome in terms of CHB development in autoantibody exposed fetuses. Objectives. This thesis is divided into two parts and investigates the pathogenic mechanism and the genetic association with CHB. The first study aims to identify cross-reactive targets of anti-Ro52/p200 antibodies by screening a library of peptides covering the whole human proteome and using monoclonal antibodies specific for the Ro52/p200 region and to confirm the reactivity at peptide level and on the whole antigen level. The second study aims to identify fetal susceptibility genes among the Human Leucocyte Antigen (HLA) locus in anti-Ro/SSA autoantibody-mediated CHB from DNA samples collected from a multi-centric European cohort of families in which children affected by CHB were born. Part I. A whole proteome microarray revealed 17 peptides to be significantly cross-reactive with a Ro52/p200 monoclonal antibody (Ab31) and two linear motifs (“YSDF” and “YSNF) were shared among these sequences. Among the targets, cross-reactivity was studied in detail for TG and GAK, for which reactivity was showed both at the peptide and whole protein level with anti-p200 monoclonal antibodies and with sera from mothers whose children have CHB, suggesting that reactivity to these protein could represent a risk factor for development of CHB in the fetuses in anti-Ro/SSA-positive pregnancies. Part II. DNA from 636 individuals of 173 European families in which children affected from CHB were born (119 Swedish, 38 Finnish, 2 Norwegian and 14 Italian families) was genotyped and imputation of HLA class I and HLA class II loci was performed. From the analysis, HLA-Cw*06, -DRB1*13, -DQA1*01 and -DQB1*06 emerged as a protective alleles associated with CHB development, while HLA-DQA1*04 transmissions were associated with susceptibility. Furthermore, haplotype analysis revealed that the DRB1-DQA1-DQB1 13-01:03-06:03 haplotype significantly associated with protection from CHB development, while DRB1-DQA1-DQB1 08-04:01-04:02 was significantly associated with CHB susceptibility. A parent-of-origin effect was seen for the following alleles: a lower maternal transmission to affected children was associated with Cw*06, while lower paternal transmission was observed for DQB1*06 and DRB1*07. With these findings, we propose that HLA typing in anti-Ro52-positive pregnancies might be a useful tool to assess the risk of CHB in the fetuses.

Introduzione. Il blocco avtrio-ventricolare (BAV) congenito è una malattia autoimmune passiva associata al trasferimento transplacentare di anticorpi materni anti-Ro/SSA e/o anti-La/SSB, causando infiammazione e fibrosi del nodo atrio-ventricolare con successivo blocco cardiaco nel feto. Nonostante l’associazione diretta degli anticorpi materni nell'indurre il BAV sia da lungo nota, i meccanismi patogenetici coinvolti rimangono poco chiari e l'identificazione di bersagli di cross-reattività degli anticorpi anti-Ro52 nel cuore fetale è oggetto di dibattito. In aggiunta, Il BAV si verifica nel 1-2% delle gravidanze in cui sono presenti anticorpi anti-Ro/SSA e ha un tasso di ricorrenza del 12-20% nelle una successive gravidanze, suggerendo che fattori aggiuntivi, quali genetici e ambientali sono coinvolti nello sviluppo del BAV. Obiettivi. La prima parte della tesi riguarda uno studio che ha avuto lo scopo di identificare i bersagli di cross-reattività degli anticorpi anti-Ro52/p200 attraverso uno screening di una libreria peptidica coprente l'intero proteoma umano e l'utilizzo di anticorpi monoclonali specifici per la regione p200 della proteina Ro52. Ulteriore obiettivo è quello di confermare la reattività a livello di peptide e a quello di intero antigene. Il secondo studio ha lo scopo di studiare l’associazione genetica del locus “Human Leucocyte Antigen” (HLA) con il BAV in una coorte di famiglie europee in cui sono nati bambini con BAV. Parte I. Lo screening su base proteomica ha individuato 17 peptidi significativamente cross-reattivi con un anticorpo monoclonale specifico per la regione p200 (Ab31). Tra le 17 sequenze sono stati trovati due motivi lineari condivisi ("YSDF" e "YSNF). Tra i target positivamente legati dall’anticorpo Ab31, la cross-reattività è stata ulteriormente studiata per TG e GAK, per i quali la reattività è stata dimostrata sia a livello peptidico, che e a livello di proteina intera, usando anticorpi monoclonali anti-p200 e sieri di madri i cui figli hanno il BAV. Reattività verso queste proteine potrebbe rappresentare un fattore di rischio maggiore per lo sviluppo del BAV nei feti in gravidanze positive per gli anticorpi anti-Ro/SSA. Parte II. Campioni di DNA provenienti da 636 individui da 173 famiglie europee in cui sono nati bambini affetti da BAV (119 svedesi, 38 finlandesi, 2 norvegese e 14 italiane) è stato genotipizzato ed è stata eseguita l'imputazione dei loci HLA di classe I ed HLA di classe II. Dall'analisi è emerso che gli alleli HLA-Cw*06, -DRB1*13, -DQA1*01 e -DQB1*06 conferiscono protezione dallo sviluppo BAV, mentre la trasmissione ai feti di HLA-DQA1*04 conferisce suscettibilità alla malattia. Inoltre, l'analisi ha rivelato che l’aplotipo DRB1-DQA1-DQB1 13-01:03-06:03 è significativamente associato con la protezione dallo sviluppo BAV, mentre DRB1-DQA1-DQB1 08-04:01-04:02 è significativamente associato con suscettibilità al BAV. Infine, è’ stato osservato anche un effetto di origine parentale per questi alleli: -Cw*06 è associato una minore trasmissione materna ai bambini affetti, mentre DQB1*06 e DRB1*07 sono associati ad una inferiore trasmissione paterna. Con questi risultati, proponiamo che la genotipizzazione di questi alleli in gravidanze anti-Ro52-positive potrebbe essere un utile strumento per valutare il rischio di sviluppo del BAV nei feti.