REGULATION OF AUTOPHAGY AND THE UBIQUITIN-€“ PROTEASOME SYSTEM BY THE FoxO TRANSCRIPTIONAL NETWORK DURING MUSCLE ATROPHY

Skeletal muscle can adapt its mass in response to physical activity, metabolism and hormones. The control of muscle size depends on the coordinated balance between protein synthesis and protein degradation. Mechanical overload or anabolic hormonal stimulation shifts the balance towards protein synthesis leading to an increase in fiber size, a process called hypertrophy. Conversely, in catabolic conditions protein degradation exceeds protein synthesis resulting into muscle weakness and muscle atrophy. Muscle loss and weakness occurs in several pathological conditions like disuse, denervation, immobilization, sepsis, burn injury, cancer, AIDS, diabetes, heart and renal failure and in aging. Muscle atrophy is an active process which requires the activation of specific signalling pathways and transcriptional programs. Gene expression studies revealed a set of genes, named atrogenes (atrophy related genes), which are commonly up- and down-regulated in different catabolic conditions (Bodine et al., 2001; Gomes et al., 2001; Lecker et al., 2004; Sacheck et al., 2007; Sandri et al., 2004). These genes encode for enzymes that catalyze important steps in autophagy-lysosome pathway, ubiquitin-proteasome system, unfolded protein response, ROS detoxification, DNA repair, mitochondrial function and energy balance pathways. Skeletal muscle growth is regulated by the IGF1-AKT-mTOR-FoxO signalling pathway (Sandri, 2013). FoxO family of transcription factors activity is suppressed during growth by AKT. On the other hand, in the absence of growth factors, like IGF1 or insulin, AKT is not activated and does not block FoxOs which can translocate into the nucleus and interact with promoters of their target genes (Sandri et al., 2004). Activation of FoxOs promotes the expression of the essential atrophy-related ubiquitin ligases atrogin-1 and MuRF-1 and leads to a dramatic loss of muscle mass (Kamei et al., 2004; Sandri et al., 2004). In addition, autophagy and expression of autophagy-related genes is also under FoxO3 control (Mammucari et al., 2007; Zhao et al., 2007). Thus FoxO coordinates the two major proteolytic system of the cell, the autophagy-lysosome and the ubiquitin-proteasome. However, the activation of the few atrogenes reported to be regulated by FoxO cannot sustain all the protein breakdown during atrophy. Nevertheless several other genes among the atrogenes are of potential interest but their particular role and regulation in muscle wasting is still unknown. Moreover, other unknown players are certainly important for muscle protein breakdown. For this reason, in this PhD project we propose, by a loss of function approach, to unravel the role of FoxO family in gene regulation and muscle adaptation during catabolic conditions. The FoxO family in skeletal muscle is comprised of four isoforms: FoxO1, FoxO3, FoxO4 and FoxO6. Therefore, to simultaneously delete the three major expressed FoxO genes in skeletal muscle, we generated muscle-specific conditional FoxO1,3,4 knockout mice. These animals resulted to be fully viable, phenotypically normal and indistinguishable in appearance from aged-matched control mice. To characterize the role of FoxO1,3,4 in skeletal muscle, we analyzed the phenotype of knockout mice under conditions of muscle wasting. Initially we used starvation as a model of muscle loss. because it is an established condition that induces nuclear translocation of FoxO members and their binding to target promoters (Mammucari et al., 2007; Sandri et al., 2004). Interestingly, FoxO1,3,4 knock-out mice were completely protected from muscle loss and muscle weakness after fasting. Moreover, deletion of FoxO resulted in suppression of autophagy during fasting. To further determine if the role of FoxO1,3,4 is critical in different catabolic conditions, we then used denervation as another model of muscle atrophy. Quantification of fibre size revealed that FoxO-deficient muscles were partially protected from atrophy. Thus, FoxO family members are necessary for muscle loss but their involvement in the atrophy programme depends on the catabolic condition. Since muscle atrophy is characterized by a transcriptional-dependent regulation of atrogenes we decided to perform gene expression profiling in fed and fasting conditions in FoxO1,3,4 -/- and controls to identify genes under FoxO regulation. Then, we compared the list of FoxO-dependent genes with the list of atrogenes and we founded that 29 of 63 atrophy related-genes were not induced in FoxO null muscles during fasting. Interestingly, the lists of FoxO-dependent genes during denervation and fasting do not completely overlap confirming that FoxO trascription factors are more sensitive in conditions of nutrient deprivation. Finally we identified new FoxO-dependent ubiquitin ligases including MUSA1 recently identified in our lab and another one that we name SMART (Specific of Muscle Atrophy and Regulated by Transcription). We confirmed by IP experiments that SMART forms an SCF complex with Skp1, Cullin1 and Roc1 and therefore belongs to the SCF family of E3 ligases. To validate the hypothesis that SMART had a role in promoting atrophy during denervation, we knocked down SMART in tibialis anterior in vivo in innervated and denervated muscles. Importantly, SMART inhibition significantly protected denervated muscles from atrophy. Therefore, SMART is an additional critical gene whose upregulation is required for atrophy. In conclusion, this PhD project identified the FoxO signature in protein breakdown. This information would be valuable in order to block muscle wasting in many systemic disease and to promote pharmacological strategies against muscle loss.

Il muscolo scheletrico è in grado di adattare la sua massa in risposta all’ esercizio fisico, al metabolismo e a gli ormoni. Il controllo della massa muscolare dipende quindi da un coordinato equilibrio tra sintesi e degradazione proteica. L’esercizio fisico e gli stimoli anabolici spostano questo equilibrio verso la sintesi proteica, la quale porta ad un aumento delle dimensioni delle fibre muscolari attraverso un processo noto come ipertrofia. Al contrario, in condizioni cataboliche, la degradazione proteica aumenta rispetto alla sintesi portando a debolezza muscolare e atrofia. La perdita di massa e forza sono una conseguenza di diverse condizioni patalogiche come il disuso, la denervazione, l’ immobilizzazione, la sepsi, ustioni, cancro, AIDS, diabete ed invecchiamento. L’atrofia muscolare è un processo catabolico che richiede l’attivazione di specifiche vie di segnale e programmi trascrizionali. Studi di espressione genica hanno identificato un set di geni, chiamati atrogenes (geni correlati all’atrofia), che sono comunemente up-regolati e down- regolati in differenti condizioni cataboliche. (Bodine et al., 2001; Gomes et al., 2001; Lecker et al., 2004; Sacheck et al., 2007; Sandri et al., 2004). Questi geni codificano per enzimi che catalizzano importanti step nei principali pathway cellulari come il sistema autofagico lisosomiale, il sistema ubiquitina-proteasoma, stress del reticolo, sistemi di riparazione del DNA ed enzimi che regolano attività mitocondriali. La crescita muscolare è regolata dalla via di segnale IGF1-AKT-mTOR-FoxO (Sandri, 2013). L’ attività dei fattori trascrizionali FoxO è quindi abolita durante la crescita muscolare tramite l’ attivazione della chinasi AKT. In assenza però di fattori di crescita come IGF1 o insulina, la chinasi AKT non è attivata e risulta dunque incapace di bloccare FoxO che può traslocare nel nucleo e legare i promotori dei suoi geni target (Sandri et al., 2004). L’ attivazione dei fattori FoxO promuove l’espressione di essenziali ubiquitine ligasi legate all’ atrofia atrogin-1 e MuRF-1 e porta ad una drammatica perdita della massa muscolare (Kamei et al., 2004; Sandri et al., 2004), inoltre è noto che l’autofagia e l’espressione di alcuni dei geni correlati all’ atrofia sono sotto il controllo del fattore trascrizionale FoxO3 (Mammucari et al., 2007; Zhao et al., 2007). I fattori FoxO coordinano i due principali sistemi proteolitici della cellula: il sistema autofagico lisosomiale e il sistema ubiquitina proteasoma. Tuttavia, l’ attivazione degli atrogenes controllati trascrizionalmente da FoxO non è sufficiente, da sola, a giustificare la completa perdita della massa muscolare; tra gli atrogenes vi sono dunque diversi altri geni che giocano un ruolo di potenziale interesse nella regolazione nell’ atrofia muscolare la cui funzione però, è ancora sconosciuta. Per questo motivo, nel mio progetto di dottorato, abbiamo caratterizzato attraverso la metodica del loss of function il ruolo dei fattori trascrizionali FoxO nella regolazione genica e nell’ adattamento del muscolo scheletrico in condizioni cataboliche. La famiglia dei fattori trascrizionali FoxO comprende 4 isoforme FoxO1, FoxO3, FoxO4 e FoxO6. Per eliminare simultaneamente i fattori FoxO specificamente nel muscolo abbiamo generato dei topi knock-out muscolo specifici per i fattori FoxO1,3,4 che sono principalmente espressi nel muscolo. Questi animali sono risultati essere vitali, ed apparentemente indistinguibili dai loro topi di controllo. Per caratterizzare il ruolo dei fattori Foxo1,3,4 nel muscolo scheletrico, abbiamo analizzato il fenotipo dei topi knock-out in condizioni in cui vi era perdita di massa. Inizialmente abbiamo utilizzato il digiuno, una delle condizioni in cui FoxO è attivo e trasloca nel nucleo dove trascrive i suoi geni target, come modello di atrofia. I topi FoxO1,3,4 erano completamente protetti dalla perdita di massa e forza in seguito al digiuno, ed inoltre la delezione dei fattori FoxO portava ad un completo blocco del flusso autofagico durante il digiuno. Per determinare se il ruolo dei fattori FoxO è critico nelle differenti condizioni di atrofia, abbiamo deciso di utilizzare la denervazione come altro modello di perdita di massa muscolare. La quantificazione dell’ area delle fibre mostrava in questo caso una parziale protezione dall’ atrofia suggerendo che i fattori FoxO sono necessari nel promuovere la perdita di massa ma il loro coinvolgimento nel programma atrofico dipende dal dipo di condizione catabolica. Com’è noto l’ atrofia muscolare è caratterizzata dall’ attivazione di uno specifico programma genico, dunque, abbiamo per prima cosa identificato i geni regolati trascrizionalmente da FoxO attraverso un’ analisi di gene expression profiling condotta su topi FoxO1,3,4 knock-out e controlli , alimentati e a digiuno. Abbiamo quindi paragonato la lista dei geni regolati da FoxO con la lista degli atrogenes e abbiamo trovato che 29 di 63 atrogenes non erano espressi nei muscoli dei topi FoxO knock-out durante il digiuno. Degno di nota è che la lista dei geni controllati da FoxO nella denervazione e nel digiuno non era completamente sovrapponibile confermando che i fattori FoxO erano maggiormente coinvolti nel processo atrofico in condizioni di carenza di nutrienti. Infine abbiamo identificato nuove ubiquitine ligasi regolate dai fattori FoxO tra cui MUSA1, recentemente identificata nel nostro laboratorio, e una nuova unquitina ligasi a cui abbiamo dato il nome di SMART (Specific of Muscle Atrophy and Regulated by Transcription). Attraverso esperimenti di immunoprecipitazione abbiamo confermato che SMART apparteneva alla famiglia delle E3 ubiquitina ligasi SCF dal momento che formava un complesso con le altre componenti Skp1, Cullin1 e Roc1 . Successivamente per validare l’ipotesi che SMART avesse un ruolo nel promuovere l’ atrofia muscolare abbiamo bloccato la sua espressione nei muscoli tibiali di topi innervati e denervati e abbiamo constatato che il blocco di SMART proteggeva i muscoli denervati dall’ altrofia. Pertanto, SMART rappresenta un nuovo gene critico per il programma atrofico. In conclusione, questo progetto di dottorato identifica il ruolo di FoxO nella perdita di massa muscolare. Queste informazioni potrebbero risultare utili per combattere l’ atrofia muscolare in molte malattie sistemiche suggerendo nuove strategie farmacologiche che blocchino la perdita di massa muscolare.