The role of nitric oxide in cancer immunotherapy

The adoptive cell therapy (ACT) represents one promising and realistic strategy to treat cancer patients trough cancer immunotherapy. This clinical approach consists in the transfer of CD8+ T lymphocytes, specific for tumor antigens. The effectiveness of ACT so far is limited by crucial events as the trafficking of adoptively transferred cells to the tumor site and the highly immunosuppressive environment of developing cancer. Tumors are complex and flexible lesions where cancer cells and host immune cells dynamically interact. The immunosuppressive functions are exerted by distinct cell populations as myeloid derived suppressor cells (MDSCs) and tumor associated macrophages (TAMs) that are known to suppress T cell proliferation in several ways. One is based on the coordinated up regulation and activity of two specific enzymes: arginase (ARG1) and nitric oxide synthase type 2 (NOS2 or iNOS). At the tumor site, ARG1 induces the depletion of the amino acid L- arginine that is necessary for T cell activation and proliferation. NOS2 is responsible for the generation of nitric oxide (NO) and other reactive nitrogen species (RNS). These free radicals are known to impair T cell functions within the tumor. Additionally, our group recently described a novel tumor-associated immunosuppressive mechanism based on post-translational modifications of chemokines by RNS. NO has dual role in cancer biology because it can promote both tumor progression as well as tumor regression. NO induces tumor progression and metastasis by direct induction of tumor-cell proliferation, migration and invasion, and indirectly through the expression of angiogenic and lymphangiogenic factors in tumor cells. On the other hand, high doses of NO have cytotoxic effects, which can result in tumor regression and metastasis inhibition. This dichotomous behavior mainly depends on the quantity, location, and timing of NO production and on the cellular sensitivity to this radical. The primary aim of the study was elucidate the role of NOS2 and its principal product NO in the tumor microenvironment and more specifically in the ACT approach. To this purpose, we performed in vivo experiments of ACT in either wild type or Nos2 knock-out mouse models, challenged with a tumor cell line expressing the OVA antigen. Instrumental for dissecting the role of NO in ACT was the setting of a valuable tools whether to monitor in real-time NO release by confocal microscopy on viable tumor slices after T cell interaction or sorting isolation of specific population responsible for NO induction after ACT. Our study proposed an innovative approach to study NO dynamics within intact tumor microenvironment. Our approach was instrumental for the definition -for the first time in tumors- of a new subset of myeloid population, named TNF/iNOS producing dendritic cells (Tip-DCs), with antitumor activity mediated by NOS2 and consequently NO. Mostly important our study brought the awareness that NOS2 is fundamental for the effectiveness of ACT, opening new perspectives to improve cancer immunotherapy based on NOS2/NO modulation in tumors.

L’immunoterapia cellulare adottiva (indicata di seguito con l’acronimo inglese ACT) oggi rappresenta una promettente strategia per il trattamento di pazienti affetti da cancro. Quest’approccio clinico consiste nel trasferimento adottivo di linfociti T CD8+, specifici per gli antigeni tumorali. L’efficacia dell’ACT è limitata da alcuni eventi fondamentali come il richiamo delle cellule trasferite nel sito tumorale e l’ambiente molto immunosoppressivo in cui si sviluppa il cancro. I tumori sono delle lesioni complesse e dinamiche, nelle quali le cellule neoplastiche interagiscono con le cellule del sistema immunitario dell’ospite. Nel tumore, l’immunosoppressione è mediata da alcune popolazioni cellulari come le cellule mieloidi e i macrofagi associati al tumore, noti per sopprimere la proliferazione delle cellule T in diversi modi. Uno di questi è la sovraespressione e l’attività coordinata di due enzimi: l’arginasi (ARG1) e l’ossido nitrico sintasi 2 (NOS2 o iNOS). Nel sito tumorale ARG1 induce la deplezione dell’aminoacido L-arginina, necessaria per l’attivazione e la proliferazione delle cellule T. NOS2 è responsabile della sintesi dell’ossido nitrico e altre specie reattive dell’azoto. Questi radicali liberi sono noti bloccare le funzioni delle cellule T nel tumore. Inoltre, il nostro gruppo recentemente ha descritto un nuovo meccanismo d’immunosoppressione associato al tumore basato sulle modifiche post- traduzionali indotte dalle specie reattive dell’azoto sulle chemochine. L’ossido nitrico ha un duplice ruolo nella biologia del cancro poiché può promuovere come inibire la progressione tumorale. L’ossido nitrico induce la progressione tumorale e le metastasi agendo direttamente sulla proliferazione e migrazione delle cellule tumorali e indirettamente attraverso l’espressione di fattori angiogenici e linfoangiogenici. Tuttavia, una elevata concentrazione di ossido nitrico può causare effetti citotossici che possono condurre alla regressione tumorale e l’inibizione delle metastasi. Questa dicotomia dipende principalmente dalla quantità, dalla localizzazione e dalla cinetica di generazione dell’ossido nitrico e soprattutto dalla sensibilità cellulare all’esposizione di questo radicale. L’obiettivo primario di questo studio è stato di delucidare il ruolo di NOS2 e del suo principale prodotto (ossido nitrico) nel microambiente tumorale, in particolare nell’approccio clinico dell’ immunoterapia cellulare adottiva. Abbiamo svolto esperimenti di trasferimento adottivo sia nel modello animale wild type che nel modello Nos2 knock-out, nei quali si è indotto lo sviluppo di tumori mediante l' inoculo di una linea tumorale esprimente l’antigene ovalbumina (OVA). Allo scopo di chiarire il ruolo dell’ossido nitrico nell’immunoterapia cellulare adottiva, si è rivelato fondamentale la messa a punto di valide metodiche per monitorare il rilascio di questo radicale in tempo reale attraverso la microscopia confocale, che è stata condotta su “fettine” vitali di tumore in seguito all’interazione con le cellule T e l’isolamento tramite delle cellule responsabili dell’induzione di ossido nitrico dopo l’immunoterapia cellulare adottiva. Il nostro lavoro introduce un approccio innovativo per lo studio delle dinamiche dell’NO nel microambiente tumorale. Tale approccio è stato fondamentale per l’identificazione, per la prima volta nei tumori, di una nuova sottopopolazione mieloide, denominata “cellule dendritiche TNF/iNOS producenti” (Tip-DCs), caratterizzate da attività antitumorale che è mediata da NOS2 e conseguente produzione di ossido nitrico. Principalmente il nostro studio porta la consapevolezza che la NOS2 è fondamentale per l’efficacia dell’ACT, aprendo nuove prospettive per il miglioramento dell’immunoterapia del cancro basata sulla modulazione di NOS2 e dell’ossido nitrico nei tumori.