Antimicrobial peptide-mediated immune response in four Bombyx mori strains infected with Gram-positive and -negative pathogens

The domesticated silkworm Bombyx mori is an important organism for its intrinsic economic and biotechnological value, but also for representing a model organism for Lepidoptera genetics. Silkworm strains can be grouped into four geographical types (Japanese, Chinese, European and Tropical) characterized by a different resistance to infections, which is inversely correlated to the silk productivity. The aim of this project was to characterize which are the main elements of the immune response protecting Bombyx mori against pathogen infections, with the final purpose to obtain silkworms enhanced in their pathogen-resistance, but still maintaining good production capabilities. To achieve this objective, two main approaches have been used: 1) the characterization of the humoral immune response to oral infection of four B. mori strains originating from Japan, China, Europe and India, focusing on antimicrobial peptides (AMPs), important effectors of the innate immunity; 2) the production and characterization of transgenic silkworms over-expressing specific AMPs. We first characterized the four strain under germ-free conditions for the structure of their peritrophic membranes and intestinal epithelia, which represent the first barriers for oral infection. Moreover, we evaluated the genetic variability of the four strains at the level of the 21 B. mori AMP genes, identifying several amino acid substitutions in the active portion of peptides. To determine the possible differential sensitivity to microbial attack, we performed infection experiments in which each B. mori line was exposed to two silkworm pathogens, the Gram-positive Enterococcus mundtii or the Gram-negative Serratia marcescens. After a 24h oral infection, the differential response to pathogens of the four strains was determined by comparing 1) the survival profiles, 2) the presence of living pathogen cells in the hemolymph circulation, 3) the expression induction of 9 representative AMP genes in the tissues involved in the immune response (fat bodies and midgut), 4) the in vitro antimicrobial activity of the silkworm hemolymph, 5) the Lysozyme concentration in larvae plasma and 6) the rate of the melanization reaction. Regarding the E. mundtii infection, the European line was found to be the most resistant, followed by the Chinese, the Indian and the Japanese strains. Our data suggest that the key resistance factor might consist in the AMP classes and/or isoforms produced in the European strain at both local and systemic levels. Regarding the S. marcescens infection, the Indian strain was completely resistant, while none of the other three strains survived to the microbial exposure. We found a general correlation between the survival profile and the systemic AMP transcription activation. In fact, the Indian line was the only one which showed a systemic induction of most AMPs and in which no viable bacteria were found in the hemolymph. Further analyses are required to explore whether this strain-specific resistance is due to more efficient mechanisms in the Gram-negative recognition process or in the signal transduction pathway activation. In order to obtain transgenic silkworm strains with enhanced pathogen resistance, we generated three different piggyBac-based constructs to achieve the over-expression of moricin, gloverin2 or cecropinB at the level of fat bodies. Currently, 2 independent lines over-expressing moricin have been obtained and are under evaluation for their resistance to infections.

Il baco da seta, Bombyx mori, oltre a possedere un’importanza economica intrinseca, è ampiamente utilizzato sia come sistema modello per i Lepidotteri, che nel campo delle biotecnologie. In seguito alla domesticazione si sono originati numerosi ceppi, che possono essere classificati sulla base della loro origine geografica in giapponesi, cinesi, europei e tropicali. In genere, i ceppi che provengono dalle aree temperate mostrano una maggiore produttività, ma anche una più alta suscettibilità alle infezioni, mentre i ceppi di origine tropicale risultano essere più resistenti alle infezioni. Lo scopo di questo progetto consisteva nell’identificare quali potessero essere gli elementi chiave della resistenza del B. mori alle infezioni. Il fine ultimo era di creare dei ceppi di baco da seta che fossero più tolleranti ai patogeni, ma che mantenessero comunque buone capacità produttive. Per raggiungere questi obiettivi, sono stati utilizzate due principali strategie: 1) la caratterizzazione della risposta immunitaria indotta da infezioni orali di quattro ceppi di baco da seta originatisi rispettivamente in Giappone, Cina, Europa ed India, ponendo particolare attenzione sui peptidi antimicrobici (AMP), i principali effettori dell’immunità innata; 2) la produzione e la caratterizzazione di linee transgeniche over-esprimenti i geni codificanti gli AMP. In primo luogo abbiamo caratterizzato la morfologia delle membrane peritrofiche e degli epiteli intestinali dei quattro ceppi allevati in condizioni sterili. Queste strutture rappresentano la prima barriera fisica durante le infezioni orali. Successivamente, abbiamo valutato la variabilità genetica dei quattro ceppi a livello dei 21 geni codificanti per gli AMP di B. mori, identificando numerose sostituzioni amminoacidiche nella porzione attiva dei peptidi. Abbiamo quindi sottoposto i quattro ceppi ad infezione orale con due batteri, specifici patogeni del baco da seta: Enterococcus mundtii, Gram-positivo, e Serratia marcescens, Gram-negativo. In seguito ad un’infezione di 24 ore abbiamo valutato la risposta differenziale dei quattro ceppi confrontando: 1) i profili di sopravvivenza, 2) la presenza di cellule batteriche vive nell’emolinfa, 3) l’induzione dell’espressione dei geni codificanti 9 AMP rappresentativi, 4) l’attività antimicrobica dell’emolinfa, 5) la concentrazione del Lisozima nel plasma, 6) la velocità di melanizzazione dell’emolinfa. Per quanto riguarda l’infezione con E. mundtii, il ceppo europeo è risultato essere il più resistente, seguito dal cinese, dall’indiano e dal giapponese. I dati ottenuti indicano che le classi e i tipi di AMP prodotti dal ceppo europeo, sia a livello locale che a quello sistemico, possano essere l’effettiva causa della maggiore resistenza di questo ceppo. A seguito dell’infezione con S. marcescens, il ceppo Indiano si è rivelato essere totalmente resistente a questo patogeno, mentre nessuno degli altri tre ceppi è sopravvissuto all’infezione. Abbiamo trovato una generale correlazione tra il profilo di sopravvivenza e l’attivazione sistemica degli AMP. Infatti nell’emolinfa dei bachi da seta indiani non sono state isolate cellule batteriche di S. marcescens e solamente questo ceppo ha mostrato un’induzione della trascrizione della maggior parte degli AMP. Sono necessarie ulteriori analisi per verificare se il ceppo indiano possieda meccanismi di riconoscimento o vie di trasduzione del segnale più efficaci per questo tipo di infezione. Infine sono stati generati tre differenti costrutti basati sull’elemento trasponibile piggyBac per ottenere ceppi di baco da seta transgenici con una maggiore resistenza alle infezioni. Sono state ottenute due linee indipendenti over-esprimenti il gene per la Moricina. Al momento si stanno caratterizzando queste linee per verificare la loro resistenza alle infezioni.