Investigating the role of extracellular matrix in regulating signaling pathways and embryonic development

During my PhD I was involved in different projects exploiting the zebrafish animal model in order to analyse the role of extracellular matrix proteins in regulating signaling pathways. In particular, in the first period of my PhD, I focused my attention on the in vivo function of Emilin3 in zebrafish animal model, with the aim of fully understanding the biological role of this extracellular matrix glycoprotein, both in embryonic development and in tissue homeostasis. In particular, I have contributed to in vivo studies, using several genetic approaches. These results demonstrated that Emilin3, a component of the peri-notochordal basement membrane, is required not only for the proper maturation of the notochord, but also for the regulation of Hedgehog signals derived from the notochord itself. Moreover, I also contributed to in vitro experiments that allowed us to understand how Emilin3 limits Hedgehog signals secreted by the notochord. We found that Emilin3 is able to interact with Scube2, a secreted factor that acts in a permissive way in the generation of Hedgehog ligand gradients. In this context, I generated several deletion constructs of Emilin3 and Scube2, which allowed us to determine the specific action of Emilin3, revealing that this extracellular matrix protein is able to interact with the EGF motifs of Scube2. Overall, this study revealed that the interaction between Emilin3 and Scube2 within the peri-notochordal basement membrane is essential for the proper notochord patterning activity. Such results were published in a full article in Development (Corallo et al., 2013). Alongside this work, my increasing interest on notochord patterning and functions led me to contribute to two review manuscripts on this subject (Corallo et al., Cell Mol Life Sci 2015; Corallo et al., J Cell Sci, in preparation). Since the second year of my PhD, I independently started new functional studies in zebrafish focused on the role of Collagen VI during embryonic development. Mutations of Collagen VI genes in humans are causative for different forms of inherited muscle diseases, including Bethlem myopathy and Ullrich dystrophy. Previous work carried out in Collagen VI knockout (Col6a1–/–) mice revealed a crucial role for this extracellular matrix component in tissues homeostasis, and in particular in skeletal muscles, and demonstrated that ablation of Collagen VI has a remarkable impact on cell survival and organelle turnover. Indeed, these studies showed that collagen VI deficiency is causative for the myopatic syndrome of the mouse model and patients, characterized by spontaneous apoptosis, organelles alterations and deficient autophagy in muscle fibers. Although past work demonstrated that Collagen VI is broadly and dynamically expressed in a large number of tissues during embryonic development and postnatal life, no study until now ever assessed which roles Collagen VI plays during development and whether and how this major extracellular matrix component is regulating signaling pathways. Therefore, the aim of this part of my PhD work was to investigate which signaling pathways and tissues are affected by ablation of Collagen VI, in particular during embryonic development and using zebrafish as a model organism. Towards this aim, I first carried out a characterization of the structure, organization and gene expression of Collagen VI chains in zebrafish. These information were the basis for further functional studies. By means of morpholino-mediated Collagen VI knockdown in different transgenic reporter zebrafish lines, I identified not only an alteration of muscle fibers development, but also an axonal growth defect of motor neurons in Collagen VI morphant embryos. In addition, knockdown of Collagen VI led to variations in Wnt and BMP signals during embryogenesis, thus suggesting a possible correlation between the developmental defects and the signaling pathway alterations caused by Collagen VI knockdown. Finally, I successfully applied the CRISPR/Cas9 technology for in vivo site-specific mutagenesis, generating a zebrafish col6a1 VI null line that represents a valuable tool for the thorough understanding of the functions of Collagen VI during development and in regulating signaling pathways.

Durante i tre anni di dottorato ho preso parte a diversi progetti, in cui ho utilizzato l’organismo modello di zebrafish per capire il ruolo di diverse proteine della matrice extracellulare nel regolare le vie di trasduzione del segnale. Il mio primo progetto di dottorato ha riguardato lo studio di funzione della proteina della matrice extracellulare Emilina3 nel modello animale di zebrafish, al fine di comprendere appieno il ruolo biologico di questa glicoproteina nello sviluppo embrionale e nell’omeostasi tissutale. In particolare ho contribuito agli esperimenti in vivo, sfruttando tecniche di forward genetic, che dimostrano come Emilina3, componente della matrice extracellulare che sta attorno alla notocorda, è necessaria non solo per la corretta maturazione della notocorda ma anche e per la regolazione dei segnali di Hedgehog derivanti dalla notocorda stessa. Inoltre, ho contribuito agli esperimenti in vitro che hanno permesso di comprendere come Emilina3 limiti i segnali di Hedgehog secreti dalla notocorda: questa proteina è in grado di interagire e sequestrare un fattore secreto che agisce in maniera permissiva nel rilascio dei ligandi di Hedgehog, Scube2. In questo contesto, ho generato diversi costrutti di Emilina3 e Scube2, deleti nei loro diversi domini, necessari per saggi di legame in vitro che hanno permesso di comprendere che Emilina3 è in grado di interagire specificatamente con le ripetizioni EGF di Scube2. Nel complesso, questo studio ha stabilito per la prima volta come l'interazione tra Emilina3 e Scube2 nella membrana basale della notocorda è fondamentale per la corretta attività di patterning della notocorda stessa. Tali ricerche sono state oggetto di pubblicazione (Corallo et al., Development 2013). A margine di questo lavoro, le attività di documentazione e studio delle più recenti scoperte riguardo la notocorda hanno portato all’elaborazione di due reviews sull’argomento (Corallo et al., CMLS 2015; Corallo et al., JCS in preparazione). A partire dal secondo anno di dottorato, ho utilizzato il modello animale di zebrafish per avviare in maniera indipendente studi funzionali, volti a comprendere il ruolo del collagene VI durante lo sviluppo embrionale. Numerosi studi precedentemente effettuati dal nostro gruppo sui topi privi di collagene VI (Col6a1 knockout) hanno rivelato un ruolo cruciale di tale componente della matrice extracellulare nell’omeostasi dei tessuti, ed in particolare di quello muscolare. Tali studi dimostrano che il deficit di collagene VI determina l’insorgenza di una sindrome miopatica a carico dei muscoli, caratterizzata da apoptosi spontanea, alterazioni agli organelli e deficit di autofagia nelle fibre muscolari. Analoghe alterazioni sono state evidenziate nei muscoli dei pazienti affetti da miopatia di Bethlem e distrofia di Ullrich, due patologie umane legate a mutazione dei geni codificanti per il collagene VI. Il mio progetto è nato da queste premesse: l'obiettivo è comprendere appieno, in assenza del collagene VI, quali alterazioni tissutali e molecolari avvengono utilizzando l’organismo modello di zebrafish In particolare, ho condotto una caratterizzazione della struttura, dell'organizzazione genica e dell'espressione delle catene del collagene VI nell’organismo modello di zebrafish. Tutte queste informazioni sono alla base per studi funzionali. In particolare, attraverso il silenziamento genico mediato da morfolino del collagene VI in diverse linee transgeniche reporter di zebrafish, ho iniziato a indagare quali vie di segnalazione e tessuti sono affetti dall'assenza di questa importante componente della matrice extracellulare. In particolare ho individuato non solo un’alterazione dello sviluppo delle fibre muscolari, ma anche un difetto di crescita assonale dei motoneuroni negli embrioni morfanti per il collagene VI. Inoltre, ho anche osservato un’alterazione nelle vie di segnale di Wnt e BMP; e in futuro si prospetta di trovare una correlazione tra le alterazioni di sviluppo dei tessuti e quelle delle vie di segnale. In parallelo, ho applicato con successo la nuova tecnica di mutagenesi sito-specifica CRISPR/Cas9, generando una linea di zebrafish priva di collagene VI, al fine di confermare ed estendere i risultati ottenuti. Questi studi sono di particolare rilievo, in quanto per la prima volta indagano alterazioni finora sconosciute dei meccanismi molecolari legati a deficit di collagene VI, aprendo così la strada ad ulteriori studi nei pazienti affetti da patologie legate al collagene VI.