Nanoparticelle d'oro e tecniche NMR: dallo studio della Formazione del Monostrato all'Interazione Molecolare

The ability to control the self-assembly of a gold nanoparticle monolayer made of organic molecules is an important goal in nanoscience research. To achieve the control, it is necessary to understand both the monolayer structure and the monolayer formation process and its evolution in time. In this PhD thesis are reported the results obtained from a study of the monolayer formation process in the presence of a couple of thiols. Exploiting the Peng1 synthesis protocol and its implementation by Scrimin2 (that allows the formation of the gold colloid to be separated from the passivation of the surface) mixed monolayer gold nanoparticles have been synthesized and studied concerning their composition, morphology and function. In particular, the synthesis, the purification steps and the studies have been finely tuned relying on the gold nanoparticles solubility. A Phosphorylcholine, zwitterionic thiol 2 and an Alkyl, neutral thiol 24 have been selected (Fig. A1). The resulting nanoparticles have intrinsic chemical and physical properties that are different from those shown by the relative mono-thiol protected nanoparticles. Figure A1: Representation of the thiols passivating the nanoparticles. The different mixed monolayer populations are separated relaying on their solubility and analyzed by NMR spectroscopy coupled with lanthanides ions. In the experimental protocol, the selected thiols are added onto a solution of gold nanoparticles stabilized with dioctylamine and the reaction mixture is immediately splitted. The first portion is allowed stirring for 24 hours, while the second portion is readily analyzed (t=0). In this way it is possible to obtain information about the early monolayer composition that is the kinetic product of the reaction. Moreover allowing the system stirring for 24 hours it is possible to obtain information about the thermodynamic product of the reaction too. Purification requires two steps: 1) water is added to the reaction mixture and the hydrophilic nanoparticles are extracted; 2) the remaining reaction mixture (toluene) is evaporated and the residue is washed to eliminate the reagent excess (dioctylamine and tetraoctylamonium) and to isolate the hydrophobic nanoparticles (Fig. A2). Figure A2: Separation protocol of the nanoparticles relying on their solubility. When the thiols are simultaneously added, what happens is a total segregation on different nanoparticles. This situation changes if the thiols are added within a 24 hours delay: in this case mixed monolayer nanoparticles are obtained. The process seems to be very complex: the Alkyl 24 thiol (the first thiol to be added) rapidly and completely covers some nanoparticles and equally redistributes in a longer time. The following thiol Phosphorylcholine freeze the system allowing the analysis. The monolayer composition is hence driven by the velocity of the involved processes. NMR titrations with Gd3+ ions marked the tendency of this couple of thiols to randomly cover the nanoparticle surface, indicating the probable formation of a kinetic product. On the other hand, if the mixed monolayer is obtained by thiol exchange, the results show the formation of patches monolayer, indicating the probable formation of a thermodynamic product.3 Beside the monolayer formation studies, the PhD focused also on the creation of a NMR sensor basing on gold nanoparticles for the identification of interacting molecules. One of the biggest problem with molecular sensors is the univocal identification of the molecules in a complex mixture; in fact what is normally detected is a variation of a property of the sensor and not a property of the analyte. This may lead to false positive/negative results because even and interfering molecules could give the same results as the analyte. A new protocol based on NMR spectroscopy that allows the identification and the quantification of complex mixtures is shown.4, 5 Previous studies marked that organic monolayer protected nanoparticles act as a supramolecular sensor. The first experimental protocol exploits the NOE-pumping technique6 (Fig. A3), the Overhauser nuclear effect assisted diffusion. The principle is to discriminate little interacting molecules from non-interacting molecules by magnetic transfer of the nanoparticle to the interacting analytes. The experiment is divided in two steps: the first features a diffusion filter that eliminates all the coherences of little molecules (not the nanoparticles') basing of their fast diffusion coefficients; the second features a NOE experiment where the signals come from the polarization transfer from the nanoparticle, that survived the diffusion filter, to the interacting mlecules. Hence, gold nanoparticles are polarization storages and selectively transfer it to the interacting analytes. The resulting signals directly come from the analytes and not from the sensor. Figure A3: Schema riguardante l'esperimento di NMR chemosensing. When interaction is selective and the analyte rapidly exchanges with nanoparticles in the diffusion time scale, nanoparticles can serve as magnetization source that can be selectively transferred to the interacting molecule. In this way, only the signals of the interacting molecules will appear on the final NMR spectrum demonstrating that NOE-pumping is a useful technique to discriminate analytes basing on their affinity for the nanoparticles. Interacting molecules can also be detected by diffusion coefficient perturbation exploiting DOSY technique. Furthermore, experiments performed on diazobenzene,7 showed that these techniques can be exploited to study system with responsive behaviours. * Bibliografia (1) Jana, N. R.; Peng, X. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 14280. (2) Manea, F.; Bindoli, C.; Polizzi, S.; Lay, L.; Scrimin, P. Langmuir 2008, 24, 4120. (3) Guarino, G.; Rastrelli, F.; Scrimin, P.; Mancin, F. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 7200. (4) Perrone, B.; Springhetti, S.; Ramadori, F.; Rastrelli, F.; Mancin, F. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 11768. (5) Salvia, M.-V.; Rarnadori, F.; Springhetti, S.; Diez-Castellnou, M.; Perrone, B.; Rastrelli, F.; Mancin, F. Journal of the American Chemical Society 2015, 137, 886. (6) Chen, A.; Shapiro, M. J. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 10258. (7) Bandara, H. M. D.; Burdette, S. C. Chemical Society Reviews 2012, 41, 1809.

L'abilità  di controllare l'autoassemblaggio di un monostrato organico di molecole che ricopre una nanoparticella dìoro è un'importante meta della ricerca nell'ambito delle nanoscienze. Per guadagnare questa abilità è necessario comprendere non solo la struttura ma anche il processo di formazione del monostrato e la sua evoluzione nel tempo. In questa tesi di dottorato sono stati riportati i risultati ottenuti dallo studio del processo di formazione del monostrato in presenza di coppie di tioli diverse. Utilizzando la sintesi proposta da Peng1 e successivamente modificata da Scrimin2, che permette di gestire in maniera separata la formazione del nucleo d'oro da quella del monostrato di tioli che passiva le nanoparticelle, sono state sintetizzate nanoparticelle d'oro con monostrato misto e ne sono state studiate composizione, morfologia e funzioni. In particolare, nell'ambito di questo progetto di dottorato è stato messo a punto un protocollo per la sintesi, l'isolamento e lo studio di nanoparticelle passivate da differenti coppie di tioli, basato sulla loro solubilità . Sono stati selezionati un tiolo a carattere zwitterionico 2 Fosforilcolina e un tipo di tiolo neutro a carattere Alchilico 24 (Fig. A1). Le nanoparticelle che si ottengono hanno delle intrinseche proprietà  chimiche e di solubilità  che sono diverse dalle proprietà  che manifestano le nanoparticelle ricoperte dai singoli tioli. Figura A1: Rappresentazione dei tioli che passivano le nanoparticelle. Le varie popolazioni ottenute vengono separate in base alla loro solubilità  e analizzate mediante l'utilizzo della spettroscopia NMR accoppiata con l'uso di ioni lantanidi. In questi esperimenti, i tioli selezionati vengono aggiunti ad una soluzione di particelle stabilizzate con diottilammina e la miscela di reazione viene immediatamente divisa in due porzioni. Una delle due viene lasciata sotto agitazione per 24 h, mentre la seconda viene immediatamente interrotta e analizzata (t=0). In questo modo, è possibile ottenere informazioni sulla composizione dei monostrati appena formati che corrispondono al prodotto cinetico della reazione, e dopo un tempo sufficientemente lungo a far evolvere il sistema verso una situazione termodinamicamente più stabile. L'analisi prevede due passaggi: 1) viene aggiunta acqua e separata la frazione di particelle idrofile; 2) la miscela di reazione (toluene) viene evaporata ed il residuo purificato per eliminare i reagenti in eccesso (diotilammina e tetraottilammonio) e isolare le particelle (Fig. A2). Figura A2: Schema di separazione delle nanoparticelle in base alla loro solubilità . Quando i due tioli vengono aggiunti simultaneamente quello che si verifica è una segregazione totale su diverse nanoparticelle, situazione che tende a mutare muovendosi verso la formazione di nanoparticelle miste se i due tioli vengono aggiunti a 24 h di distanza l'uno dall'altro. Quello che sembra verificarsi è un processo complesso: il tiolo 24 Alchilico, il primo ad essere aggiunto, ricopre velocemente alcune particelle per poi ridistribuirsi sulle altre in un tempo relativamente lungo, la successiva aggiunta del tiolo 2 Fosforilcolina congela la situazione permettendo l'analisi. La composizione del monostrato è quindi controllata da un sottile bilancio tra la velocità dei processi coinvolti. Titolazioni NMR con ioni Gd3+ hanno sottolineato come questa coppia di tioli tenda a disporsi in maniera casuale sul nucleo d'oro, indicando, probabilmente, la formazione di un prodotto cinetico. Se il monostrato misto è invece ottenuto mediante scambio di tioli ciò che emerge è una distribuzione a piccole isole, indicando probabilmente la formazione di un prodotto termodinamico.3 Parallelamente, agli studi sulla formazione del monostrato questo progetto di dottorato si è incentrato anche sull'ideazione di un sensore NMR basato su nanoparticelle d'oro, per l'identificazione di molecole interagenti. Un problema ancora irrisolto nell'ambito dei sensori molecolari è quello di identificare in maniera univoca le molecole rilevate dal sensore in una miscela complessa; infatti spesso ciò che viene rilevato fa parte di una proprietà  intrinseca del sensore stesso, ma non fornisce nessuna informazione certa sulla natura dell'analita. è, quindi, facile immaginare, come anche un interferente possa generare la medesima risposta in un sensore. Nel laboratorio dove è stato svolto questo progetto di dottorato è stato messo a punto un nuovo protocollo basato sulla spettroscopia NMR, che permette l'identificazione e la quantificazione di miscele complesse. Infatti, studi precedenti hanno messo in evidenza come le nanoparticelle ricoperte da un monostrato di molecole organiche siano in grado di agire come recettori supramolecolari.4, 5 Il primo esperimento utilizzato è stata la tecnica NOE-pumping6 (Fig. A3), che utilizza l'effetto nucleare Overhauser di diffusione assistita. Il concetto è quello di riuscire a identificare le piccole molecole interagenti da tutte le molecole che non si legano alla nanoparticella attraverso il trasferimento della magnetizzazione da questa agli analiti. L'esperimento è suddiviso in due parti: la prima è composta da un filtro di diffusione in cui tutte le coerenze delle piccole molecole, ma non delle nanoparticelle, vengono eliminate causando, di fatto, una cancellazione dei segnali delle molecole per la loro veloce diffusione; la seconda parte è composta da un esperimento NOE, alla conclusione del quale, i segnali rilevati derivano dal trasferimento di polarizzazione dalle nanoparticelle, sopravvissute al filtro di diffusione, alle specie che interagiscono con esse. Le nanoparticelle d'oro servono, quindi, a immagazzinare la polarizzazione e a trasferirla selettivamente ai soli analiti riconosciuti dalle nanoparticelle stesse. A questo punto, quindi, i segnali rilevati non derivano dal sensore, ma bensì, direttamente dall'analita. Figura A3: Schema riguardante l'esperimento di NMR chemosensing. Quando l'interazione è selettiva e l'analita è in regime di scambio veloce con la nanoparticella nella scala dei tempi della diffusione, la nanoparticella può essere usata come fonte di magnetizzazione che può essere trasferita selettivamente alla molecola interagente sfruttando il NOE. In questo modo, solo i segnali delle specie interagenti saranno visualizzati nello spettro NMR finale, quindi, l'esperimento NOE-pumping permette di discriminare gli analiti per la loro affinità  con le nanoparticelle stesse. Non solo è possibile rilevare molecole interagenti per trasferimento della magnetizzazione, ma anche, per perturbazione dei coefficienti di diffusione, utilizzando la tecnica DOSY. Inoltre, esperimenti condotti su un diazobenzene,7 hanno permesso di stabilire che queste tecniche possono essere utilizzate per studiare sistemi che possiedono comportamenti responsivi. * Bibliografia (1) Jana, N. R.; Peng, X. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 14280. (2) Manea, F.; Bindoli, C.; Polizzi, S.; Lay, L.; Scrimin, P. Langmuir 2008, 24, 4120. (3) Guarino, G.; Rastrelli, F.; Scrimin, P.; Mancin, F. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 7200. (4) Perrone, B.; Springhetti, S.; Ramadori, F.; Rastrelli, F.; Mancin, F. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 11768. (5) Salvia, M.-V.; Rarnadori, F.; Springhetti, S.; Diez-Castellnou, M.; Perrone, B.; Rastrelli, F.; Mancin, F. Journal of the American Chemical Society 2015, 137, 886. (6) Chen, A.; Shapiro, M. J. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 10258. (7) Bandara, H. M. D.; Burdette, S. C. Chemical Society Reviews 2012, 41, 1809.