Molecular identification of ATP sensitive Mitochondrial Potassium Channel (mitoKATP)

Mitochondria ATP-sensitive potassium channels (mitoKATP) were first described in 1991 by direct patch clamp of isolated mitoplasts (i.e. mitochondria lacking the outer membrane). Since then, a growing amount of evidences showed that they are implicated in the control of a variety of mitochondrial functions. Most importantly, pharmacological modulation of the mitoKATP can efficiently protect the heart from ischemia/reperfusion injury. However, despite its huge therapeutic potential, the molecular identity of the mitoKATP is still unknown. Here we identify a protein complex that is sufficient to reconstitute a functional K+ permeant channel with the same pharmacological profile of the mitoKATP. In particular, we demonstrate that the mitoKATP is a heterooligomer composed by two different components. One is a previously uncharacterized protein of unknown function that we now name “mitoK”. The other is a protein belonging to the ABC superfamily here named “mitoSUR”. It possesses a nucleotide-binding site (a standard Walker motif) and provides ATP sensitivity to the mitoK pore-forming subunit through direct protein interaction. In detail, we demonstrated that mitoK is a mitochondrial protein located in the inner mitochondrial membrane (IMM), with two transmembrane domains and both its N- and C-termini exposed to the organelle matrix. Its overexpression induces a decrease in mitochondrial Ca2+ transients evoked by agonist stimulation, a drastic reduction of mitochondria membrane potential, fragmentation of the mitochondrial network and a derangement of the IMM ultrastructure, with the total collapse of the cristae. However, all these effect can be rescued by the concomitant overexpression of mitoSUR, but not by the expression of the mitoSURK513A mutant that lacks ATP binding. Most importantly, in vitro reconstitution of purified mitoK and mitoSUR in a planar lipid bilayer form a channel i) selective for monovalent cations, ii) blocked by tetraethyl ammonium (TEA, a general inhibitor of K+ channels), iii) sensitive to ATP, iv) activated by diazoxide and v) inhibited by 5-HD. Finally, we focused our efforts to understand the physiological role of mitoKATP. According to the available literature, mitoKATP channels are believed to be protective in ischemia/reperfusion injury. However, the broad conservation profile among all vertebrates suggests that the mitoKATP should also have a primary housekeeping function. In order to analyze the genuine physiological role of the mitoKATP, we generated Hela cells knockout for mitoK by using the Crispr/Cas9 technology. Two different guides targeting different gene regions were validated and several Hela mitoKKO clones were obtained. Overall, ablation of mitoK leads to no gross defects in mitochondria morphology, although an impairment of cristae structure becomes evident through electron microscopy. Mitochondrial membrane potential is overall intact and expression of respiratory chain complexes is unaffected. However, we noticed that Hela mitoKKO cells undergo to asynchronous, rapid and transient depolarizations of single mitochondria, a phenome known as “flickering” of mitochondria membrane potential. Therefore, oxygen consumption rate (OCR) is greatly impaired in Hela mitoKKO cells when compared to their wild type counterparts, in both basal, leaky (oligomycin induced) and maximal (i.e. FCCP induced) respiration. As already reported, mitochondrial K+ homeostasis is fundamental to regulate mitochondrial matrix volume: while excessive accumulation leads to organelle swelling, a decrease in K+ uptake is predicted to cause matrix contraction, with obvious consequences on the performance of the oxidative phosphorylation. Overall, our data indicates that mitoKATP is a central regulator of mitochondrial function that modulates the efficiency of energy production according to the ATP availability through the regulation of matrix volume.

I canali mitocondriali del potassio sensibili all’ATP (mitoKATP) sono stati descritti per la prima volta nel 1991 in seguito ad esperimento di patch clamp su mitoplasti (mitocondri privi della membrana mitocondriale esterna) isolati. Da allora, un numero crescente di esperimenti ha dimostrato il coinvolgimento di questi canali nella regolazione di numerose funzioni mitocondriali. In particolare, la modulazione farmacologia di questi canali può efficacemente proteggere il cuore dal danno da ischemia/riperfusione. Tuttavia, nonostante il loro enorme potenziale terapeutico, la struttura molecolare dei canali mitoKATP è ancora oggi sconosciuta. In questo lavoro abbiamo identificato un complesso proteico permeabile al K+ con lo stesso profilo farmacologico dei canali mitoKATP. In particolare, abbiamo dimostrato come questi canali siano composti da due differenti subunità. Una di queste è una proteina non ancora caratterizzata dal punto di vista biologico e con funzione sconosciuta, che d’ora in poi chiameremo “mitoK” . L’altra componente del canale è una proteina appartenente alla superfamiglia delle proteine ABC, che chiameremo “mitoSUR”. Quest’ultima possiede un dominio in grado di legare ATP (chiamato “dominio Walker”) attraverso cui fornisce sensibilità ai canali mitoKATP attraverso una interazione diretta con mitoK. In particolare, abbiamo dimostrato che mitoK è una proteina mitocondriale sita sulla membrana mitocondriale interna, con due domini transmembrana e le rispettive porzioni N- e C- terminale esposte nella matrice. La sovraespressione di mitoK induce una diminuzione dell’accumulo mitocondriale dello ione calcio in risposta a stimoli, una drastica riduzione del potenziale di membrana mitocondriale, frammentazione della morfologia mitocondriale ed una perdita totale delle cristae. Tuttavia, le normali funzioni mitocondriali possono essere recuperate attraverso la contemporanea sovraespressione di mitoSUR, ma non dall’espressione del mutante mitoSURK513A mancante del dominio che lega ATP. Inoltre, l’espressione in vitro delle proteine purificate mitoK e mitoSUR ed il loro inserimento in una membrana artificiale ci ha permesso di studiarne le caratteristiche elettrofisiologiche, dimostrando che mitoK e mitoSUR formano un canale i) selettivo per cationi monovalenti, ii) inibito da ammonio tetraetile (TEA, un inibitore generico per i canali K+), iii) sensibile ad ATP, iv) attivato da diazossido e v) inibito da 5-HD. Infine abbiamo cercato di comprendere il ruolo fisiologico dei canali mitoKATP. Secondo la letteratura disponibile, questi canali hanno un ruolo protettivo nel danno da ischemia/riperfusione. Tuttavia, l’ampio profilo di conservazione tra tutti i vertebrati suggerisce che i canali mitoKATP abbiano prima di tutto un ruolo nel controllo delle normali funzioni mitocondriali. Al fine di analizzare il vero e proprio ruolo fisiologico di questi canali mitoKATP, abbiamo generato cellule Hela prive del gene che codifica per mitoK utilizzando la tecnologia Crispr/Cas9. Utilizzando due differenti guide in grado di riconoscere due diverse regioni del gene sono stati ottenuti alcuni cloni cellulari privi di mitoK a livello proteico. Nel complesso, la mancanza di mitoK non comporta alcun difetto in termini di morfologia mitocondriale, anche se è evidente una diversa strutture delle cristae attraverso la microscopia elettronica. Il potenziale di membrana mitocondriale è complessivamente intatto e l’espressione dei complessi della catena respiratoria è inalterata. Tuttavia, abbiamo notato che le cellule Hela mitoKKO vanno incontro a depolarizzazioni asincrone, rapide e transitorie, caratteristiche di un fenomeno conosciuto come “flickering” del potenziale di membrana mitocondriale. Abbiamo inoltre osservato che il consumo di ossigeno (OCR) è notevolmente ridotto in questi cloni rispetto alle cellule di controllo, sia in termini di respirazione basale che massimale. Dalla letteratura è infatti noto che l’omeostasi mitocondriale del potassio è fondamentale per regolare il volume della matrice mitocondriale; mentre un accumulo eccesivo di K+ comporta un aumento del volume, una diminuzione dell’accumulo di K+ può causare la contrazione della matrice, con ovvie conseguenze sulle prestazioni della fosforilazione ossidativa. Nel complesso, i nostri dati indicano che i canali mitoKATP regolano le funzioni mitocondriali, modulando l’efficienza della produzione di energia secondo la disponibilità di ATP attraverso la regolazione del volume della matrice.