Biotechnological optimization of microalgae for the sustainable production of biocommodities

The current global economy development trends strongly rely on fossil fuels exploitation, which are responsible for a net greenhouse gases (e.g. CO2) release in the atmosphere. In 2014, the Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) stated that this net atmospheric CO2 increase is anthropogenic, and it will lead to the rising of the global temperature of > 2 °C, before the end of this century. The latter will strongly contribute to change the behavior of climate and oceans (e.g. leading to their acidification and oxygenation) in a permanent way, with a consequent magnification of the demographic pressures on food and water security, as well as on several ecosystems functional bio-diversity. To avoid this apocalyptic scenario, the development of renewable and clean energy sources to sustain a consistent part of the global economy is an unavoidable challenge for our society. A plant biomass-based economy could meet this need, but several studies predicted a food prices inflation and a concrete carbon debt, as consequence of this scenario. On the contrary, the exploitation of microalgae biomass could indeed avoid these issues and bring a positive effect on atmospheric CO2 levels, leading to its sequestration and fixation in organic carbon. Currently, microalgae are indeed the best CO2 sequestering organisms, thanks to higher photosynthetic rates with respect to plants. Their ability to grow on marginal lands and use wastewaters opens the doors for their application as environment-impact mitigating agents of current industrial processes. Their exploitation could be indeed the key for the development of an integrate process in which the biomass would be used to convert the majority of the current economy toward environmental-friendly processes. Despite this promising scenario, mainly wild type microalgae species are currently available for these purposes. Their evolution in a natural environment, different from the artificial one exploited during their intensive industrial cultivation, strongly impairs their theoretical biomass productivities, leading to unsatisfactory values. The development of an algae-based economy indeed depends on the efficient conversion of light energy into biomass and the optimization of metabolic pathways to maximize the synthesis of the products of interest. Still far from the development of an economically competitive and energetically sustainable microalgae industrial cultivation, these organisms therefore need to undergo a biotechnological optimization to achieve the competitiveness threshold. Although there isn’t an ideal species that could serve to meet all human needs, we focused on the seawater species Nannochloropsis gaditana, which is a promising candidate for both basic biological and applied investigations. The following PhD thesis was conceived to provide a molecular insight on N. gaditana photosynthetic efficiency and metabolic regulation, to provide the molecular targets for its biotechnological improvement. The prerequisite of this experimental work was the optimization of the currently available molecular toolkit for N. gaditana genetic manipulation and also the available molecular information was therefore significantly improved. In chapter II random mutagenesis approaches were performed in order to isolate mutant strains with photosynthetic phenotypes, likely more suitable for intensive growth conditions. Selected strains indeed showed an improved photosynthesis in limiting growth conditions, also serving as biological tools to improve the available information on the underlying molecular elements controlling light-use efficiency in this organism. When tested in lab-scale growth conditions, the strain E2, selected for a reduction in its Chl content, indeed showed an improved biomass productivity, therefore representing a proof of concept for the developed biotechnological approaches, to able to improve the photosynthetic performances of this organism in the artificial environment of a photobioreactor. Among the isolated mutant strains, in chapter III two major photosynthetic phenotypes, the reduction in the Chl content (strain E2) and the inability to activate NPQ (strain I48), were chosen as selection criteria to improve light penetration and energy conversion mechanisms, respectively, in an intensive culture. Both indeed showed an enhanced biomass productivity in industrial-simulating cultures, proving the theoretical advantage underneath their exploitation. However, when the growth conditions changed, leading to altering the light availability, the selected mutants altered their behavior. They weren’t able of performing better than the WT in all the tested conditions. This would explain why the data published to date for the same mutants in other species often provided contrasting results. We concluded that photosynthetic mutants can modulate their phenotype in relation to the growth conditions and some of the latter could indeed highlight their drawbacks rather than their benefits, therefore the genetic engineering efforts have to be tailored properly to the growth conditions used. The forward genetics strategy here developed could open the doors toward the identification of the molecular basis regulating photosynthesis in this promising species. In chapter IV mutant strain I48 was further investigate for the identification of the genetic basis of its phenotype. Thanks to the whole genome re-sequencing we identified a splicing variant in the 5’-donor splicing site of the 4th intron of the gene Naga_100173g12, which encodes for the LHCX1 protein. This mutation caused the retention of the intron sequence, leading to a truncated protein product, which is likely degraded. The absence of the LHCX1 protein strongly correlates with inability to activate NPQ, since this proteins clade is well known to be involved in the activation of this mechanism. However, the future complementation of the phenotype will serve to validate this conclusion. Moreover, the LHCX1 protein was found co-localized with the PSI in N. gaditana, therefore strain I48 could also serve as an optimal tool to investigate further its biological role. To develop an efficient biotechnological optimization strategy, the information on the metabolism regulation of N. gaditana has to be highly enriched. Understanding the metabolic fluxes direction could lead to specifically affect those involved in a specific product accumulation, without affecting other pathways, leading to a possible negative impact on growth. In chapter V an integrated analysis of genome-wide, biochemical and physiological approaches helped us in deciphering the metabolic remodeling of N. gaditana that switches its metabolism toward a greater lipid production in excess light conditions. The latter indeed induced the accumulation of DAGs and TAGs, together with the up-regulation of genes involved in their biosynthesis. We saw the induction of cytosolic fatty acids synthase (FAS1) genes and the down-regulation of those of the chloroplast (FAS2). Lipid accumulation is accompanied by the regulation of triose phosphate/inorganic phosphate transport across the chloroplast membranes, tuning the carbon metabolic allocation between cell compartments and favoring the cytoplasm and endoplasmic reticulum at the expense of the chloroplast. This highlighted the flexibility of N. gaditana metabolism to respond to environmental needs. In chapter VI the information gained from the latter work was exploited to test the potentiality of this prosing species also as protein expression platform. We built up a modular system for protein overexpression in which the regulatory sequences were chosen among those which revealed to induce a high level of transcription or to be highly regulated by light availability. N. gaditana revealed to be a very promising host for protein expression, given the higher luciferase activity monitored with respect to the reference species for these applications, C. reinhardtii. A method to test the efficacy of several regulatory sequences in driving proteins expression was developed, as well as several expression vectors, which are ready to be tested. The investigation of the N. gaditana metabolism regulation in chapter V, showed a fine tuning of its photosynthetic apparatus components, in different light conditions. Focusing on LHC proteins we identified a new LHCX protein in this species, called LHCX3 (GENE ID: Naga_101036g3), whose gene coding sequence wasn’t annotated correctly. In chapter VII the correct coding sequence of this gene was further investigated and experimentally validated with molecular techniques. The LHCX3 protein revealed to be fused with an N-terminal fasciclin I-like domain and a sequence analysis together with a preliminary evolution study was performed to infer the biological role of this association. Since algae metabolism entirely relies on light availability, the importance of investigating the light intensity effect on growth is seminal for their industrial application. In chapter VIII we developed a micro-scale platform, that we called micro-photobioreactor, to easy investigate the impact of light intensity on N. gaditana growth. We were able to test the effect of different light regimes, simultaneously, also on the photosynthetic performances in an integrate system which could be merged with nutrients availability studies, speeding up the N. gaditana characterization process. Three appendix sections are also included in the thesis in which some of the experimental techniques exploited in this work were applied to different organisms toward the common target of investigating light-use efficiency and the molecular elements involved in its regulation. In appendix I, the development of a mathematical prediction model for growth and fluorescence data of the species Nannochloropsis salina was described. The work was carried out in collaboration with Prof. Fabrizio Bezzo of the industrial engineering department of the University of Padova. The development of behavior prediction models representing the phenomena affecting algae growth, could be very helpful in designing and optimizing the production systems at industrial level. The developed model well represented N. salina growth over a wide range of light intensities, and could be further implemented to describe also the influence on growth of other parameters, such as nutrients availability and mixing. In appendix II, the monitoring of the in vivo chlorophyll fluorescence was exploited to study the photosynthetic features of rice plants exposed to salt stress conditions. The presented results are part of a wider project (in collaboration with Prof. Fiorella Lo Schiavo from the biology department of the University of Padova), aiming to depict the physiological, biochemical and molecular remodeling, undergoing in one of the major food crop in the world, in response to salt stress conditions. Depicting the impact of environmental stresses on photosynthesis is seminal to control biomass productivity since plants metabolism strongly relies on the former for growth. We showed the activation of the NPQ mechanism in salt tolerant plants, highlighting the importance of photosynthetic features monitoring to predict plants performances, directly on the field. In appendix III, Chlamydomonas reinhardtii 13C – 15N labeled thylakoids were isolated from the cw15 and npq2 mutant strain in order to study their structure and dynamics in term of protein and lipid components in situ, by applying the solid-state NMR technique, in collaboration with Prof. Anjali Pandit group from the Leiden Institute of Chemistry. These analyses will serve to investigate the photosynthetic membranes remodeling that undergoes from an active (cw15 strain) to a photo-protective state (npq 2 mutant strain), during the switch toward excess light conditions, with the final aim to understand the biochemical processes regulating this event.

Le attuali tendenze di sviluppo economico mondiale si basano fortemente sullo sfruttamento di combustibili fossili, che sono responsabili di un netto rilascio di gas serra (ad esempio CO2) nell'atmosfera. Nel 2014, il gruppo intergovernativo di esperti sui cambiamenti climatici (IPCC), ha dichiarato che questo incremento netto di CO2 atmosferica è di origine antropogenica, e che porterà all’aumento della temperatura globale di > 2 °C, prima della fine di questo secolo. Quest'ultimo contribuirà fortemente alla modifica del comportamento del clima e degli oceani (ad esempio portando alla loro acidificazione ed ossigenazione) in modo permanente, con conseguente aumento delle pressioni demografiche sulla sicurezza alimentare e idrica, nonché sulla bio-diversità funzionale di diversi ecosistemi. Per evitare questo scenario apocalittico, lo sviluppo di fonti energetiche rinnovabili e pulite per sostenere una parte consistente dell'economia globale è una sfida inevitabile per la nostra società. Un'economia basata sulla biomassa vegetale potrebbe soddisfare questa esigenza, ma diversi studi hanno previsto un’inflazione dei prezzi alimentari e un concreto debito di carbonio, come conseguenza di questo scenario. Al contrario, lo sfruttamento della biomassa delle microalghe potrebbe in realtà evitare questi problemi e portare ad un effetto positivo sui livelli di CO2, portando al suo sequestro e fissazione in carbonio organico. Attualmente, le microalghe sono infatti i migliori organismi capaci di sequestrare la CO2, grazie a tassi fotosintetici più elevati rispetto alle piante. La loro capacità di crescere su terreni marginali e sfruttando le acque di scarto apre le porte per la loro applicazione come agenti in grado di mitigare l’impatto ambientale degli attuali processi industriali. Il loro impiego potrebbe essere infatti la chiave per lo sviluppo di un processo integrato in cui la biomassa dovrebbe essere usata per convertire la maggior dell'economia attuale verso processi rispettosi dell'ambiente. Nonostante questo scenario promettente, attualmente soprattutto specie di microalghe di tipo selvatico sono impiegate a questi scopi. La loro evoluzione in un ambiente naturale, diverso da quello artificiale sfruttato durante la coltivazione industriale intensiva, ostacola fortemente le produttività teoriche della biomassa, portando a valori insoddisfacenti. Lo sviluppo di un'economia basata sulle alghe infatti dipende dall’efficiente conversione dell'energia luminosa in biomassa e dall'ottimizzazione delle vie metaboliche per massimizzare la sintesi dei prodotti di interesse. Ancora lontani dallo sviluppo di una coltivazione industriale di microalghe economicamente competitiva ed energicamente sostenibile, questi organismi devono quindi subire un’ottimizzazione biotecnologica per raggiungere la soglia di competitività. Sebbene non ci sia una specie ideale che potrebbe servire a soddisfare tutti i bisogni umani, noi ci siamo concentrati sulla specie di acqua marina Nannochloropsis gaditana, che è un candidato promettente sia per indagini biologiche di base che applicative. La seguente tesi di dottorato è stato concepita per fornire un’investigazione molecolare sull’efficienza fotosintetica e la regolazione metabolica di N. gaditana, al fine di fornire i bersagli molecolari per il suo miglioramento biotecnologico. Il presupposto di questo lavoro sperimentale era l'ottimizzazione degli strumenti molecolari attualmente disponibili per la manipolazione genetica di N. gaditana e anche le informazioni molecolari disponibili sono state quindi significativamente migliorate. Nel capitolo II è stato eseguito un approccio di mutagenesi casuale al fine di isolare ceppi mutanti con fenotipi fotosintetici, possibilmente più adatti alle condizioni di crescita intensiva. I ceppi selezionati in effetti hanno mostrato un miglioramento della fotosintesi in condizioni di crescita limitanti, rappresentando anche degli strumenti biologici per migliorare le informazioni disponibili sugli elementi molecolari alla base del controllo dell’efficienza dell’uso della luce in questo organismo. Quando testato in condizioni di crescita su scala di laboratorio, il ceppo E2, selezionato per una riduzione del contenuto in clorofilla, ha infatti mostrato un miglioramento della produttività della biomassa, rappresentando quindi una conferma per gli approcci biotecnologici qui sviluppati, di essere in grado di migliorare le prestazioni fotosintetiche di questo organismo, nell'ambiente artificiale di un fotobioreattore. Tra i ceppi mutanti isolati, nel capitolo III, due principali fenotipi fotosintetici, la riduzione nel contenuto di clorofilla (ceppo E2) e l'impossibilità di attivare il meccanismo di NPQ (ceppo I48), sono stati scelti come criteri di selezione per migliorare, rispettivamente, i meccanismi di penetrazione della luce e di conversione dell'energia luminosa in una cultura intensiva. Entrambi infatti hanno mostrato una produttività della biomassa maggiore nelle culture che simulano le condizioni industriali, dimostrando il vantaggio teorico dato dal loro sfruttamento. Tuttavia, quando le condizioni di crescita sono state cambiate, variando la disponibilità di luce, i mutanti selezionati hanno alterato il loro comportamento. Non erano in grado di essere più produttivi del WT in tutte le condizioni testate. Questo spiegherebbe perché i dati pubblicati fino ad oggi per gli stessi mutanti, isolati in altre specie, spesso forniscano risultati contrastanti. Abbiamo quindi concluso che i mutanti fotosintetici possono modulare il loro fenotipo in relazione alle condizioni di crescita e alcune di queste potrebbero infatti evidenziare i loro svantaggi piuttosto che i loro benefici. Pertanto, i futuri approcci di ingegneria genetica dovranno essere adattati adeguatamente alle condizioni di crescita utilizzate. La strategia di genetica diretta qui sviluppata potrebbe aprire le porte verso l'individuazione delle basi molecolari che regolano la fotosintesi in questa specie promettente. Nel capitolo IV il ceppo mutante I48 è stato ulteriormente indagato per individuare le basi genetiche responsabili del suo fenotipo. Grazie al ri-sequenziamento del suo intero genoma abbiamo identificato una variante di splicing nel sito di splicing donatore al 5’ del 4 ° introne del gene Naga_100173g12, che codifica per la proteina LHCX1. Questa mutazione ha causato la ritenzione della sequenza dell’introne, portando ad un prodotto proteico tronco, che viene probabilmente degradato. L'assenza della proteina LHCX1 si correla fortemente con l'incapacità di attivare l’NPQ, dal momento che questo gruppo di proteine è ben noto per essere coinvolto nell'attivazione di tale meccanismo. Tuttavia, la futura complementazione del fenotipo servirà per validare questa conclusione. Inoltre, la proteina LHCX1 è stata trovata co-localizzata con il PSI in N. gaditana, quindi il ceppo I48 potrebbe anche servire come strumento ottimale per indagare ulteriormente il ruolo biologico di questa associazione. Per sviluppare un’efficace strategia di ottimizzazione biotecnologica, le informazioni relative alla regolazione del metabolismo di N. gaditana devono essere notevolmente arricchite. Capire la direzione dei flussi metabolici potrebbe permettere di colpire in particolare solo quelli che sono coinvolti nell’accumulo di un determinato prodotto, senza influenzare altre vie metaboliche, cosa che potrebbe portare ad un possibile impatto negativo sulla crescita. Nel capitolo V un'analisi integrata con approcci genomici, biochimici e fisiologici ci ha aiutato a decifrare il rimodellamento metabolico di N. gaditana, che porta il suo metabolismo verso una maggiore produzione di lipidi in condizioni di luce in eccesso. Quest'ultima condizione infatti induce l'accumulo di di-acilgliceroli (DAG) e tri-acilgliceroli (TAG), insieme alla sovra-regolazione di geni coinvolti nella loro biosintesi. Abbiamo visto l'induzione di geni del complesso citosolico dell’acido grasso sintasi (FAS1) e la sub-regolazione di quelli del cloroplasto (FAS2). L’accumulo di lipidi è accompagnato dalla regolazione di trasportatori di trioso fosfati / fosfato inorganico attraverso le membrane del cloroplasto, inducendo la ripartizione metabolica del carbonio tra compartimenti cellulari e favorendo il citoplasma ed il reticolo endoplasmatico a spese del cloroplasto. Ciò ha evidenziato la flessibilità del metabolismo di N. gaditana al fine di rispondere alle esigenze ambientali. Nel capitolo VI le informazioni acquisite da quest'ultimo capitolo sono state sfruttate per testare le potenzialità di questa specie promettente, anche come piattaforma di espressione di proteine. Abbiamo costruito un sistema modulare per la sovra-espressione di proteine in cui le sequenze regolatrici sono state scelte tra quelle che inducono un elevato livello di trascrizione o che sono altamente regolate dalla disponibilità di luce. N. gaditana si è rivelata essere un organismo molto promettente per l'espressione di proteine, data la maggiore attività luciferasica osservata, rispetto alla specie di riferimento per tali applicazioni, C. reinhardtii. È stato sviluppato un metodo per testare l'efficacia di diverse sequenze regolatrici nel guidare l'espressione di proteine così come sono stati preparati diversi vettori di espressione, pronti per essere testati. L'indagine della regolazione del metabolismo di N. gaditana, svolta nel capitolo V, ha mostrato una fine regolazione dei suoi componenti dell'apparato fotosintetico, in diverse condizioni di luce. Concentrandosi sulle proteine antenna, coinvolte nella cattura delle luce (light-harvesting complex (LHC) proteins) abbiamo identificato una nuova proteina LHCX in questa specie, chiamata LHCX3 (ID del gene: Naga_101036g3), la cui sequenza codificante non era annotata in modo corretto. Nel capitolo VII, la corretta sequenza codificante di questo gene è stata studiata ulteriormente e convalidata sperimentalmente con tecniche molecolari. La proteina LHCX3 ha rivelato la presenza di un dominio simile a quello di tipo fasciclina I, all’N-terminale, e sono stati eseguiti un’analisi di sequenza insieme ad uno studio evolutivo preliminare per dedurre il ruolo biologico di questa associazione. Poiché il metabolismo delle alghe si basa interamente sulla disponibilità di luce, è fondamentale indagare l'effetto dell’intensità della luce sulla crescita per studiare la loro applicazione industriale. Nel capitolo VIII, abbiamo sviluppato una piattaforma su micro-scala, che abbiamo chiamato micro-fotobioreattore, per indagare facilmente l'impatto dell’intensità della luce sulla crescita di N. gaditana. Siamo stati in grado di testare simultaneamente l'effetto di diversi regimi di luce, anche sulle prestazioni fotosintetiche, in un sistema integrato che potrebbe essere associato a studi sull’impatto delle sostanze nutritive, accelerando il processo di caratterizzazione di N. gaditana. Nella tesi sono state incluse anche tre sezioni di appendice, in cui alcune delle tecniche sperimentali sfruttate in questo lavoro sono state applicate a diversi organismi, con l'obiettivo comune di indagare l’efficienza dell’uso della luce e gli elementi molecolari coinvolti nella sua regolazione. Nell’appendice I, è stato descritto lo sviluppo di un modello matematico per la previsione dei dati di crescita e di fluorescenza, nella specie Nannochloropsis salina. Il lavoro è stato svolto in collaborazione con il Prof. Fabrizio Bezzo del dipartimento di ingegneria industriale dell'università di Padova. Lo sviluppo di modelli di previsione del comportamento che rappresentino i fenomeni che influenzano la crescita delle alghe, potrebbe essere molto utile nella progettazione e ottimizzazione dei sistemi di produzione a livello industriale. Il modello sviluppato descrive bene la crescita di N. salina in un ampio intervallo di intensità di luce, e potrebbe essere ulteriormente implementato per descrivere anche l'influenza sulla crescita di altri parametri, come la disponibilità di nutrienti ed il mescolamento. Nell’appendice II, il monitoraggio della fluorescenza della clorofilla in vivo è stato sfruttato per studiare le caratteristiche fotosintetiche di piante di riso, esposte a condizioni di stress salino. I risultati presentati sono parte di un progetto più ampio (in collaborazione con la Prof. Fiorella Lo Schiavo del dipartimento di biologia dell'università di Padova), con l'obiettivo di rappresentare il rimodellamento fisiologico, biochimico e molecolare, subito da una delle principali colture destinate ad usi alimentari nel mondo, in risposta a condizioni di stress salino. La descrizione dell'impatto degli stress ambientali sulla fotosintesi è fondamentale per controllare la produttività della biomassa delle piante poiché il loro metabolismo dipende interamente dalla fotosintesi per la crescita. Abbiamo osservato l'attivazione del meccanismo di NPQ in piante tolleranti il sale, sottolineando l'importanza del monitoraggio delle caratteristiche fotosintetiche per prevedere le prestazioni delle piante, direttamente sul campo. Nell’ appendice III, sono stati isolati i tilacoidi di Chlamydomonas reinhardtii marcati con atomi 13C - 15N, sia dal ceppo cw15 che dal ceppo mutante npq2, al fine di studiare la loro struttura e la dinamica delle proteine e dei lipidi costituenti, in situ, applicando la tecnica dell’NMR allo stato solido, in collaborazione con il gruppo del Prof. Anjali Pandit dell'Istituto di chimica di Leiden. Queste analisi serviranno per studiare il rimodellamento delle membrane fotosintetiche che passano da uno stato attivo (ceppo cw15) ad uno stato foto-protettivo (ceppo mutante npq2), durante il passaggio verso condizioni di luce in eccesso, con lo scopo finale di comprendere i processi biochimici che regolano quest'evento.