Bivalves coping with environmental changes: nanoparticles as a new potential stressor in coastal ecosystems

In the marine coastal environment, the organisms are subjected to continuous pressures of different origin. Among these, there are changes in environmental parameters, such as temperature, pH, dissolved oxygen, salinity, and the discharge of pollutants that are potentially harmful to biocoenoses. In fact, in the last century, the increasing impact of these environmental variations has been mainly related to anthropogenic activities. Although these changes are often perceived to be distant (e.g., those regarding climate change) or minimal (e.g., presence of pollutants), their impacts on the marine environment are already evident and likely to worsen with time. Even today, there are many emerging anthropogenic contaminants that are released into the environment daily. But the information about their behavior in different matrices (air, water, sediment), as well as their interactions and effects in natural populations, is very scarce. A wide group of emerging contaminants is represented by nanoparticles (NPs). NPs are used extensively in a variety of emerging technologies and commercial products, including biomedicine, pharmaceuticals and personal care products, renewable energies, and electronic devices. Consequently, NPs can enter into environment. In particular, NPs may enter marine ecosystems either directly through aerial deposition, effluents, dumping and run‐off or indirectly, e.g. via river systems. Currently, no data are available regarding NPs occurrence in the marine environment, as a consequence of the difficulty to detect and quantify NPs in complex matrices. Due to lacking analytical tools to evaluate effective NP concentrations in aquatic environments, only predicted environmental concentrations (PECs) are available in literature. Three of the widely used NPs in common products are: zinc oxide (nZnO), titanium dioxide (nTiO2) and C60 fullerene (FC60). The toxicity of nZnO, nTiO2 and FC60 NPs has been reported for different taxa of bacteria, algae, plants, and aquatic and terrestrial invertebrates and vertebrates. Nevertheless, studies concerning the potential toxicity of these NPs to marine species are still lacking. The marine clam Ruditapes philippinarum, previously used in a number of ecotoxicological studies, has been chosen as model organism in this PhD research, taking into account that bivalves are considered one of the most suitable target group to investigate NP toxicity. However, information concerning the effects of NPs to this species are lacking. Due to its filter-feeding and infaunal habits, Manila clams may be more susceptible to the effects of NPs, given that in seawater NPs tend to aggregate, adsorb to particulate matter, settle to the bottom and accumulate in sediments. The aim of the PhD thesis was to enlarge and elucidate the possible mechanisms of action and toxicity of these three NPs to the clam R. philippinarum. To reach these purposes, medium-term (7 days) exposures to three NPs (nZnO, nTiO2, FC60) were carried out. Many cellular and biochemical biomarkers in haemolymph, gills and digestive gland of clams have been measured in the perspective of a multi-biomarker approach. In this study, we chose to test low concentrations (1 and 10 μg/L) of NPs that were in the range of PEC values. Moreover, in the two metal oxide experiments the related contaminants were considered: i) ZnCl2 (10 μg/L) was used to investigate possible contributions of Zn2+ release to nZnO toxicity, and ii) bulk TiO2 (bTiO2, 10 μg/L) was used to understand the potential differing action of metal oxide compared with the respective NP. Wild organisms are generally exposed to mixtures of different chemicals, therefore the combined effects of a mixture of all three NPs have also been investigated. To assess mixture effects, clams were exposed for 7 days to i) 1 μg/L nZnO ii) 1 μg/L nTiO2 iii) 1 μg/L FC60 fullerene and iv) all three NPs as a mixture. Further, in this experiment the redox proteomic approach was adopted in combination with the multi-biomarker approach. In addition, combined effects of NP mixture and changing environmental parameters were addressed to obtain information about possible variations in clam susceptibility to NPs under a global change scenario. Salinity is one of the dominant environmental factors controlling species distribution and influencing physiological processes in marine organisms. Among predicted changes in environmental parameters, there is an increasing concern about future alterations in seawater salinity values, mainly in estuarine and coastal areas, which will affect the performance of native and invasive species. Moreover, salinity is one of the abiotic parameter that can change the behavior of NPs. In this context, to gain a better insight into the potential environmental impacts, also the native species Ruditapes decussatus was used for a comparison. In all the experiments, NPs tested were measured in clam gills and digestive gland to assess possible bioaccumulation. To get further insight into nTiO2 effects at cell level, an in vitro approach was used and phagocytic activity was assessed in clam haemocytes exposed to nTiO2 (0, 1 and 10 μg/mL). The findings confirmed the ability of nTiO2 to decrease immune functions and to enter into cells. The results of all these experiments (single and combined factors) suggested that NPs modulated various biomarker responses and showed different sub-lethal effects. The experiments on single NPs revealed significantly higher stress conditions in tissues of treated clams with major effects in gills and digestive gland. The target tissues responded differently to the three NPs, and among them, nTiO2 appeared to exert more detrimental effects in all tissues considered. This result could be determined by the metal per se, and by the nTiO2 characteristics, that, for example, could facilitate the entry into cells. Oxidative stress was confirmed to be the main mechanism of action of the three NPs investigated, as reported in literature for all NPs. The comparisons between the two metal oxide NP and their related contaminants highlighted that NPs were more toxic and this depend on NP specific features. In all clams exposed to the three NPs, at the end of exposure the Zn, Ti and FC60 contents showed an increase in treated clams compared to controls, in both NP concentrations tested. The exposure to NP mixture represents a novel approach that can provide better insight into the NP impacts under environmentally realistic conditions. Respect to single NP treatments, all findings indicated higher oxidative stress in act during the exposure to the mixture, with damage to proteins, lipids and DNA. The digestive gland was the tissue more affected by NP mixture toxicity. In all obtained results, additive effects were observed in the mixture respect to single NP exposures. The observed additive action of the NP mixture could open a new research to understand better the various mechanisms of NP toxicity. Zn, Ti and FC60 contents highlighted a bioaccumulation as single NPs and also as a mixture in both gill and digestive gland tissues. The study of interactions between different salinity (18-28-38 psu) and NP mixture exposure confirmed the NP toxicity. Overall, at all salinity values tested various changes were shown, depending on the tissues, the biomarkers and the species considered. Moreover, the comparison between the two species did not show a clear pattern of response. Although more in-depth evaluation is needed, it has to be noted that under NP exposure at the three salinities tested, the number of responses significantly varied respect to controls and was slightly higher in R. decussatus than in R. philippinarum. All PhD thesis results confirmed the toxicity of these three emerging environmental pollutants and a real potential risk for marine bivalves, even at the low concentrations tested.

A livello dell’ambiente marino costiero, gli organismi sono soggetti a continue pressioni di diversa natura. Tra queste, valutate potenzialmente dannose per le biocenosi, si possono considerare le variazioni dei parametri ambientali, quali la temperatura, il pH, l’ossigeno disciolto, la salinità, e il rilascio di inquinanti. Dal secolo scorso, il crescente impatto di questi cambiamenti ambientali è stato causato principalmente dalle attività antropiche. Anche se questi cambiamenti sono spesso percepiti come distanti (per esempio, quelli relativi ai cambiamenti climatici) o minimi (ad esempio, la presenza di sostanze inquinanti), il loro impatto sull'ambiente marino è già evidente. Quotidianamente vengono rilasciati in ambiente nuovi inquinanti di origine antropica, definiti emergenti. Le informazioni sul loro comportamento nei diversi comparti ambientali (aria, acqua, sedimenti), le loro interazioni e gli effetti sulle popolazioni naturali sono scarse. Un vasto gruppo di contaminanti emergenti è rappresentato dalle nanoparticelle (NP). Le NP sono utilizzate ampiamente in varie tecnologie emergenti e prodotti commerciali, tra cui la biomedicina, i farmaci, i prodotti per la cura e l’igiene personale, le energie rinnovabili e i dispositivi elettronici. Di conseguenza le NP possono essere rilasciate nell’ambiente. In particolare, le NP possono entrare negli ecosistemi marini sia direttamente, attraverso la deposizione aerea, gli scarichi e gli effluenti, sia indirettamente, ad esempio, tramite la rete fluviale. Attualmente, non sono disponibili dati riguardanti le concentrazioni analitiche delle NP a livello dell’ambiente marino; questa è una conseguenza della difficoltà di rilevare e quantificare le NP in matrici complesse. A causa della mancanza di strumentazioni e protocolli efficaci per misurare le loro concentrazioni negli ambienti acquatici, in letteratura sono disponibili dati sulle concentrazioni ambientali previste delle NP (Predicted Environmental Concentrations, PEC). Tre delle NP maggiormente utilizzate in prodotti di largo consumo sono: l'ossido di zinco (nZnO), il biossido di titanio (nTiO2) e il fullerene C60 (FC60). La tossicità di queste tre NP è stata riportata per diversi taxa, come i batteri, le alghe, le piante, gli invertebrati acquatici e terrestri e i vertebrati. Tuttavia, gli studi riguardanti la potenziale tossicità di queste NP nelle specie marine sono ancora molto pochi. La vongola filippina, Ruditapes philippinarum, è stata scelta come organismo modello in questa tesi di dottorato, in quanto ampiamente utilizzata in molteplici studi ecotossicologici. Inoltre, i bivalvi sono considerati uno dei target più idonei per lo studio della tossicità delle NP, anche se le informazioni riguardanti gli effetti delle NP proprio in questa specie sono carenti. Essendo un organismo filtratore che vive nel sedimento, la vongola, rispetto ad altre specie, potrebbe essere più sensibile agli effetti delle NP, visto che le NP in acqua di mare tendono ad aggregare e di conseguenza a depositarsi sul fondo e accumularsi nei sedimenti. Lo scopo di questa tesi di dottorato è quello di aumentare le informazioni e chiarire i possibili meccanismi d'azione e la tossicità di queste tre NP nella vongola filippina. Per raggiungere questo obiettivo, sono state allestite diverse esposizioni in laboratorio alle tre NP (nZnO, nTiO2, FC60) della durata di 7 giorni. Vari biomarker cellulari e biochimici sono stati misurati a livello dell’emolinfa, delle branchie e della ghiandola digestiva nella prospettiva di un approccio multi-biomarker. In questo studio, sono state scelte basse concentrazioni (1 e 10 µg/L) di NP simili ai valori di PEC. Inoltre, nei due esperimenti riguardanti le NP di ossido di metallo, il cloruro di zinco (10 µg/L) è stato utilizzato per indagare possibili contributi dello ione zinco nella tossicità del nZnO e, invece, la forma bulk del TiO2 (bTiO2, 10 µg/L) è stata utilizzata per comprendere la potenziale differente azione dell’ossido di metallo rispetto alla corrispondente NP. In ambiente gli organismi sono generalmente esposti a miscele di diverse sostanze inquinanti, per questo si è deciso di indagare l'effetto combinato di una miscela di tutte e tre le NP considerate. Per valutare gli effetti della miscela di NP, le vongole sono state esposte per 7 giorni a i) 1 µg/L di nZnO, ii) 1 µg/L di nTiO2, iii) 1 µg/L di FC60 fullerene e iv) tutte e tre le NP in miscela. In questo esperimento è stata utilizzata la proteomica redox combinata all'approccio multi-biomarker. Inoltre, sono stati studiati in un ulteriore esperimento gli effetti combinati della miscela di NP e di un parametro ambientale; per ottenere informazioni su eventuali variazioni della suscettibilità delle vongole alle NP in un possibile scenario di cambiamento globale. La salinità è uno dei fattori ambientali che controlla la distribuzione delle specie e influenza i processi fisiologici negli organismi marini. Tra i cambiamenti previsti dei vari parametri ambientali, vi è una crescente preoccupazione per le future alterazioni nei valori di salinità, soprattutto a livello degli estuari e delle zone costiere, dove potrebbero influenzare la sopravvivenza di specie autoctone e invasive. Inoltre, la salinità è uno dei parametri abiotici in grado di modificare il comportamento delle NP. In questo contesto, per ottenere una migliore comprensione dei potenziali impatti ambientali, è stata impiegata anche la specie autoctona, Ruditapes decussatus. In tutti gli esperimenti, è stato misurato il contenuto delle NP, sia nelle branchie sia nella ghiandola digestiva della vongola, per valutare il loro possibile bioaccumulo. Inoltre, per avere una visione più completa degli effetti del nTiO2 a livello cellulare, è stato utilizzato anche un approccio in vitro. I risultati hanno confermato la capacità del nTiO2 di entrare nelle cellule e di influenzare negativamente parametri legati alla risposta immunitaria. I risultati di tutti questi esperimenti hanno suggerito che le NP modulino varie risposte degli animali e hanno mostrato diversi effetti sub-letali nei tessuti della vongola. In particolare, gli esperimenti riguardanti gli effetti delle singole NP hanno mostrato condizioni di stress significativamente maggiori nelle branchie e nella ghiandola digestiva delle vongole. I tessuti analizzati hanno risposto diversamente alle tre NP, e tra loro la nTiO2 ha esercitato maggiori effetti negativi in tutti e tre i tessuti analizzati. Questo risultato potrebbe essere determinato dal metallo in sé, e dalle caratteristiche del nTiO2, che, per esempio, potrebbero facilitare l'entrata della NP nelle cellule. Lo stress ossidativo è stato confermato essere il principale meccanismo d’azione delle tre NP indagate, come riportato in letteratura. I confronti tra le NP di ossido metallico e i loro contaminanti correlati evidenziano come le NP siano più tossiche e questo dipende dalle caratteristiche specifiche delle NP. Nelle vongole esposte alle tre NP i contenuti di zinco, titanio e FC60 hanno mostrato, alla fine dell'esposizione, un aumento nei trattati rispetto ai controlli ad entrambe le concentrazioni testate. L’esperimento sulla miscela delle NP rappresenta un nuovo approccio in grado di fornire una migliore comprensione degli impatti delle NP in condizioni ambientali più realistiche. Rispetto ai risultati delle singole NP, tutti i dati ottenuti dall'esposizione delle vongole alla miscela indicano un maggiore stress ossidativo in atto, con conseguenti danni osservati alle proteine, ai lipidi e al DNA. La ghiandola digestiva risulta essere il tessuto più colpito dalla tossicità della miscela di NP. Inoltre, per tutti i parametri variati nei trattati rispetto al controllo, sono stati osservati effetti additivi nel trattamento con miscela rispetto a quelli con le singole NP. L'azione additiva riscontrata per la miscela potrebbe aprire nuovi filoni di ricerca utili a comprendere meglio i diversi meccanismi d’azione delle NP. I contenuti di Zn, Ti e FC60 quantificati anche in questo esperimento hanno evidenziato un bioaccumulo sia come singole NP, sia come miscela nelle branchie e nelle ghiandole digestive delle vongole esposte rispetto ai controlli. L’ultimo esperimento, riguardante l’interazione tra diversi valori di salinità (18-28-38 psu) e la miscela delle tre NP, conferma anche a queste condizioni la tossicità delle NP. In generale, a tutti i valori di salinità testati sono stati mostrati vari cambiamenti, in base al tessuto, ai biomarker e alla specie considerata. Il confronto tra le due specie non ha consentito di ricavare per ognuna di esse un chiaro modello di risposta alle diverse combinazioni salinità/assenza-presenza di NP saggiate. Anche se è necessaria una valutazione più approfondita, si è potuto notare tuttavia che il numero di risposte significativamente variate in presenza di miscela di NP era leggermente maggiore in R. decussatus rispetto R. philippinarum. Nel complesso, i risultati ottenuti sono in grado di fornire nuovi spunti di discussione negli studi sulla tossicità sulle NP, come pure nella valutazione del rischio, costituito dalle NP come inquinanti ambientali emergenti, negli ecosistemi marini costieri.