Pathogenetic Mechanisms of Collagen Type VI-Related Muscular Dystrophies

The overall focus of thesis is determining key disease-driving molecular pathways involved in the progression of a specific subtype of neuromuscular diseases, the collagen type VI-related muscular dystrophies (COL6RD). These kinds of muscular disorder encompass a wide spectrum of diseases, ranging from the severe Ullrich muscular dystrophy (UCMD) to the mild Bethlem myopathy (BM), characterized by a plethora of clinical manifestations. Both UCMD and BM usually arise at birth or early childhood with hypotonia and progressive muscle weakness, joint contractures and hyperlaxity of the distal joints. In UCMD, ambulation is achieved with a delay of 2 years compared to healthy children, but it is eventually lost. In BM, ambulation is generally maintained and only few affected individuals require wheel chair. Genetically, UCMD and BM are caused by mutations in the genes encoding for the three α-chains of the collagen type VI acting in a recessive or dominant way. Morphologically, the muscle biopsies of UCMD and BM patients are characterized by variable degree of atrophy, fibrosis, and regeneration and degeneration of the muscle fibers. In the present work, we systematically reviewed and classified a cohort of 22 COL6RD patient muscle biopsies and 14 age-matched control muscle biopsies according to basic histological features, such as muscle fibers atrophy and fibrosis. This classification was achieved through an innovative automatic image analysis algorithm and generated three groups, COL6RD-1, COL6RD-2 and COL6RD-3, of increasing histological severity. Microarray-based gene expression profiling and RNA-Seq of the same cohort produced gene expression fingerprint that suggested a strong segregation of COL6RD muscle biopsies from the control muscle biopsies, but did not clearly correlated with the histological grouping established among the patients. In silico analysis of the gene expression results revealed TGFβ1 pathway as the major regulator of the COL6RD histological changes and, most likely, of the underlying disease pathophysiology. TGFβ1 involvement was further confirmed by upstream regulator analysis, validation of downstream gene targets by qRT-PCR, and protein targets by western blot and immunofluorescence. Moreover, we also found a downregulation of skeletal muscle specific genes. RNA-Seq data also highlighted a deeper level of regulation of the gene expression carried over by alternative splicing. We identified 43 genes having more than one splice isoform whose expression level was significantly different between COL6RD muscle biopsies and controls, with DECORIN being the one displaying the highest number of alternatively spliced isoforms. Overall, this study suggests that different histological stages of COL6-RD are characterized by the same pattern of gene expression, involving predominantly the upregulation of matricellular components, even when the muscle involvement is not evident yet, and downregulation of muscle specific genes. Our results also suggest that TGFβ1 acts as a major driver of the pathological changes at the skeletal muscle level. Moreover, muscle biopsies from COL6-RD patients are characterized by an increase in alternative spliced isoforms of extracellular matrix-related genes that might contribute to the pathogenesis of the disease.

L’obiettivo di questa tesi è determinare i meccanismi molecolari coinvolti nella progressione di un sottogruppo specifico di malattie neuromuscolari: le distrofie muscolari congenite causate da deficit di collagene di tipo VI. Questo gruppo di distrofie comprende un ampio spettro di disordini caratterizzati da un ampio spettro di manifestazioni cliniche: dalla più grave distrofia muscolare congenita di Ulrich (UCMD) alla più moderata miopatia di Bethlem” (BM). Sia UCMD che BM si manifestano alla nascita o nel prima infanzia con ipotonia e debolezza muscolare progressiva, contrazioni delle articolazioni prossimale e iperelasticità delle articolazioni distali. Individui affetti da UCMD iniziano a deambulare con un ritardo di 2 anni rispetto ad individui sani, e la capacità deambulatoria viene poi persa nuovamente. Individui affetti da BM, invece, conservano la capacità di ambulare e solo pochi necessitano di sussidi. Dal punto di vista genetico, UCMD e BM sono causate da mutazioni che possono colpire uno o più geni codificanti le tre molecole del collagene di tipo VI. Tali mutazioni possono agire in modo dominante o recessivo. Morfologicamente le biopsie muscolari di pazienti affetti da UCMD e BM sono caratterizzate da atrofia muscolare, fibrosi, rigenerazione e degenerazione delle fibre muscolare, evidenziata dalla presenza di aree necrotiche. Nel presente lavoro, abbiamo effettuato un’analisi sistematica di 22 biopsie muscolari ottenute da pazienti affetti da COL6RD e 14 biopsie muscolari ottenuti da controlli sani di età corrispondente, che sono state suddivise in base al grado di atrofia muscolare e fibrosi. Questa classificazione è stata effettuata usando un algoritmo originale per l’analisi automatica di preparazioni istologiche, ed ha generato 3 gruppi, COL6RD-1, COL6RD-2 and COL6RD-3, di gravità istologica crescente. Le stesse biopsie sono state sottoposte a microarray e RNA-Seq ed hanno rivelato andamenti di espressione genica in forte correlazione con i gruppi definiti secondo secondo i preparati istologici, sottolineando la chiara divisione tra le biopsie muscolari di individui affetti da COL6RD e controlli. L’analisi in silico dell’espressione genica ha successivamente rivelato TGFβ1 come il maggior responsabile dei cambiamenti istologici in COL6RD e, verosimilmente, dei processi patofisiologici sottostanti. Il coinvolgimento di TGFB1 è stato ulteriormente confermato dall’ upstream regulator analysis, validazione di geni target downstream tramite qRT-PCR, e di proteine effettrici tramite western blot e immunofluorescenza. I dati ottenuti tramite RNA-Seq hanno rivelato un ulteriore livello di regolazione dell’espressione genica attuato tramite splicing alternativo. Abbiamo identificato 43 geni aventi più di una variante la cui espressione è significativamente diversa tra biopsie muscolari di COL6RD e controlli sani. Nello specifico, Decorin è il gene con il maggior numero di isoforme originate da splicing alternativo. Nel complesso, questo studio suggerisce che i diversi stadi istologici di COL6RD sono caratterizzati dallo stesso profilo di espressione genica, che coinvolge prevalentemente l’aumento di componenti della matrice extracellulare, anche in mancanza di evidenze istologiche di fibrosi, e la diminuzione di prodotti di geni muscolo-specifici. I nostri risultati suggeriscono anche che ci siano pathway molecolari TGFβ1-dipendenti che agiscono da principali regolatori dei cambiamenti patologici a livello del muscolo scheletrico. Inoltre, le biopsie muscolari provenienti da pazienti affetti da COL6RD sono caratterizzate da un aumento delle isocrone geniche generate da splicing alternativo, soprattutto per geni coinvolti nella produzione e nel mantenimento della matrice extracellulare.